DB32∕T 3788-2020 梨枯梢病监测与检测技术规程(江苏省)

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1、TCS65.020B16DB32ET由巳且，江苏省万标准DB32/T3788-2020梨枯梢病监测与检测技术规程TechnicalspecificationformonitoringanddetectionofShootBlightofAsianpear2020-04-08发布2020-05-15实施江苏省市场监督管理局发布目IJ1=1本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由江苏省农业科学院提出并归口。本标准起草单位:江苏省农业科学院。本标准主要起草人:刘凤权、徐会永、赵杨扬、赵

2、延存、孙{韦波。I梨枯梢病监测与检测技术规程1范围本标准规定了梨枯梢病监测与检测的原理、试剂与材料、仪器与用具、监测技术、检测技术、结果判定和报告、样品、菌种保藏和无害化处理、疫情处置等要求。本标准适用于梨枯梢病田间监测以及苗木、时木、接穗和果实上传带的梨枯梢病菌的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不住日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法NY/T229

3、2亚洲梨火疫病监测技术规范SN/T1157进出境植物苗木检疫规程SN/T1193基因分析检测实验室技术要求3原理梨枯梢病，病原为亚洲梨火疫病菌(ErwiniapyrifoliaeKimetal.)，是为害梨树的重要细菌病害之一，属我国规定的检疫性有害生物。可以根据田间症状、菌落形态和培养特征、致病性、免疫学反应和分子生物学特征等进行监测与检测。4试剂与材料检测中所需的所有试剂与培养基，参见附录A。除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。试验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。5仪器与用具

4、超净工作台、电子天平、磁力搅拌器、高压灭菌锅、培养箱、水浴锅、显微镜、高速台式离心机、电泳仪、常规PCR仪、凝胶成像系统、冰箱、超低温冰箱、超纯水器、恒温干燥箱、恒温摇床、微量移液器、制冰机等。6监测技术6.1监测植物梨，主要监测亚洲梨。6.2监测区域重点监测亚洲梨集中种植区、引丰中繁育基地、茵木集散地等疫情发生高风险区。6.3监测方法6.3.1苗木监测对从疫情发生区调运的苗木或疫区市场销售的苗木，按照SN/T1157要求进行抽样，并对样品进行室内检测。6.3.2田间监测从梨树开花期开始，对当地农

5、技员、果农等相关人员进行访问调查，并选择有代表性的梨园进行踏查。重点观察田间有无梨枯梢病典型症状(见附录B)，如发现可疑病株立刻进行标记、拍照并取样，样品送实验室进行进一步检测鉴定。对梨园中梨枯梢疑似症状及其发生地点、发生时间、危害情况等信息进行记录(见附录。C在疫情发生区，选择有代表性的梨因进行定点监测。从梨树开花期开始，每隔7d调查一次。采用5点取样法，每点随机调查5株，统计或计算病株率和病梢率，并做好相关记录。监测过程中病梢的选取按照NY/T2292中的规定执行。7检测技术7.1样品处理选择

6、表现典型症状并带有菌肤的植物部位女口花朵、嫩梢、幼枝、叶片或幼果等，在无菌条件下切取病健交界处组织约c3mm~5mm)xc3mm~5mm)，表面消毒和清i先后，在装有适量无菌水的离心管中轻轻挤压，浸泡10min~30min后制成样品悬浮液。或者直接挑取菌月在井用无菌水清i先后制成样品悬浮液。悬浮液可用于其后的形态观察、免疫学和分子生物学检测等。7.2检测方法7.2.1显微镜检查对于疑似症状的植物组织，切耳又病↑建交界处20mm2，平放在载玻片的水滴中，加盖玻片后，在低倍显微镜下观察有无喷菌现象。7

7、.2.2培养特征检测将样品悬浮液在YPDA培养基平板上划线或稀释分离，280C{~11直培养24h~72h。在YPDA培养基平板上观察分离得到的细菌单菌落的形状、大小、颜色、光泽、隆起的形状、粘稠度、透明度、边缘特征以及质地、71<1窑性色素等特征，观察并进行记录(参见附录B)07.2.3形态特征检测按照常规染色方法，在显微镜下观察细茵茵体的形状、大小及排列情况、有无鞭毛及鞭毛着生的位置和数目、是否产生芙膜和芽胞、芽胞着生的部位和形状、细胞内含物等特征。7.2.4致病性测定2取梨幼果(直径大约3c

8、m~5cm)洗净晾干，用灭菌刀片横切果实，置于垫有湿润的灭菌滤纸的培养皿中O用无菌接种针蘸耳又培养24h~36h的菌落，针刺接种于幼果果肉组织，一个横切面接种3个~4个点。接种后26"C保湿培养，24h后观察并记录接种部位有无坏死症状发生和菌肤形成。以无菌水为对日召7.2.5ELISA检测挑耳又少量分离到的病原菌配制成108CFU/mL悬浮液进行ELlSA检测，检测程序参见附录Do如采用商品化ELTSA方法进行检测，按照说明书进行操作及结果判定。7.2.6PCR检测挑取少量分离到的