GBT25876-2010牛早期胚胎性别的鉴定巢式PCR法.pdf

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1、ICS65．020．30B43a亘中华人民共和国国家标准GB／T25876—2010牛早期胚胎性别的鉴定巢式PCR法MethodofnestedPCRforsexidentificati帆ofearlycattleembryo2011—01-10发布2011-06一01实施宰瞀髁鬻瓣警糌瞥鐾发布中国国家标准化管理委员会促19标准分享网www.bzfxw.com免费下载刖置本标准的附录B为规范性附录，附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归口。本标

2、准起草单位：华中农业大学。本标准主要起草人：张淑君、杨利国、李翔、刘辉、刘文举、胡修忠。GB／T25876—2010www.bzfxw.com1范围牛早期胚胎性别的鉴定巢式PCR法本标准规定了牛早期胚胎性别鉴定的巢式PcR方法。本标准适用于奶牛和肉牛胚胎或胎儿的性别鉴定。2规范性引用文件GB／T25876—2010下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使

3、用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB／T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3．1巢式PcRn幅tedpolymera鸵chainn扯tion利用两套PcR引物(巢式PcR引物对)进行两轮PcR扩增反应，在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下，作为DNA模板，进行第二轮扩增。3．2职Y基因舰yg∞e哺乳动物Y染色体上决定雄性性别的基因。3．3珊B基因日BBgene卢珠蛋白基因，位于常染色体上。4

4、原理利用巢式PcR反应的敏感性高和特异性强的特性，对少量胚胎细胞的sRy基因片段进行扩增，以HBB基因的扩增作为阳性参照，电泳检测PcR扩增产物，根据扩增产物电泳条带鉴定胚胎性别。5引物SRyl5’CTACTCCCCAACCGTCAGAAC375’AGCCCAAACCCATCAACCTA3’SRY25’CCAGGGAACTGCTTGGGTA3’5’TGCTTCTCCACTTAGGCTCAA3’HBB5’TATCCCACTTACAAGGCAGGTT3www.bzfxw.com标准分享网www.bz

5、fxw.com免费下载GB／T25876—20105’GCAGACAACAGAGAACAAGAATGA36试剂和仪器6．1主要试剂水应符合GB／T668z中灭菌双蒸水的要求。n口DNA聚合酶及PcR缓冲液、100bp梯度DNA标记物。TE缓冲液、TAE缓冲液、加样缓冲液、溴化乙锭等。具体制备方法参见附录A。6．2主要仪器冷冻离心机、梯度PcR仪、电泳仪、凝胶成像系统、pH计、电子天平、恒温水浴锅、双蒸馏水器、微量移液器。7检测方法7．1试样的制备与保存从待检胚胎中分离4个(或4个以上)细胞，用无

6、菌超纯水冲洗3次后，放人o．5mLPcR管中，加入10pL无菌超纯水，100℃煮沸10min～15min，立即置于碎冰中，冷却后4℃离心(8228g)5min，取上清液保存于4℃冰箱中备用。7．2鼹y基因片段PcR扩增第一次扩增体系为20pL：o．8mmol／L的dNTP、2u的T丑qDNA聚合酶、o．2pmol／L的sRy基因外引物sRyl和内参照引物HBB、10×PcR缓冲液、2．5mm01／L的氯化镁，加适量双蒸水；反应程序为95℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃

7、延伸30s，20个循环结束后，72℃再延伸10min，4℃保温2min～10min。取第一次PcR扩增产物8pL，作为第二次扩增模板，同时加入10×PcR缓冲液、2．5mmol／L的氯化镁、o．8mmol／L的dNTP1．6pL，2u的T4口DNA聚合酶、o．2pm01／L的sRy基因内引物sRY2和内参照引物HBB、适量的双蒸水至20pL；反应程序为95℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，34个循环后，72℃再延伸10min，4℃保温2min～10min。7

8、．3结果判定取5pLPcR扩增产物，1．o％～1．5％琼脂糖凝胶电泳(3V／cm～5V／cm，电泳20min～30min)，溴化乙锭染色，凝胶成像系统检查，电泳图谱见附录B中的图B．1。电泳图谱中出现558bp(HBB扩增产物)和219bp(sRy扩增产物)条带，判定为雄性胚胎；电泳图谱中只出现558bp条带，判定为雌性胚胎。www.bzfxw.com附录A(资料性附录)试剂和材料表A．1试剂和材料GB／T25876—2010试剂配方TE缓冲液10mmol／LTris-HCl(pH8．O)，1m