利用聚合酶链反应PCR鉴定小鼠早期胚胎性别的研究

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1、西南农业大学硕士学位论文利用聚合酶链反应（PCR）鉴定小鼠早期胚胎性别的研究姓名：高嵩申请学位级别：硕士专业：临床兽医学指导教师：李跃民2003.5.1西南农业大学研究生学位论文摘要哺乳动物早期胚胎性别鉴定是生物领域的一项重大课题，同时也是胚胎工程的一个重要环节。本实验采用PCR方法，通过SRY／Sry基因的序列分析、特异性引物的设计咀及PCR检测等环节完成了对小鼠早期胚胎的性别鉴定，并建立了一套完整的PCR扩增体系。艰实验通过对几种哺乳动物SRY／Sry基因核心序列的分析，分别设计出特异于小鼠、人以及牛的三对PCR扩增引物，这三

2、对引物对雄性小鼠白细胞Sty基因的扩增率分别为96．7％、86．7％和26．7虬}前两者差异不显著(p>O．05)；前两者与后者差异显著(p<005)。扩增效果最好的为特异于小鼠Sry基因的第一对引物，其序列为：上游(Sryi)：5’GGCTACTTACGGAAGTACCAC3’；下游(Sry2)：5’GCCTATG从GAGCGCCACGTC3’。采用该对引物，分别以lOmmol／L、15mmol／L、25mmol／L以及30mmol／L的Mg”浓度配成PCR反应缓冲液扩增雄性小鼠白细胞srY，扩增率分剐为30％、60％、lOo％

3、和100％，前两者均显著低于后两者(p<0．05)。将PCR循环次数分别设为25、36和50，扩增结果基本一致，但以36次为宜。经测序，扩增产物长度为192bp，且与小鼠Sry基因核心序列相符率为98．4％，差异不显著(p>O．05)。采用确定后的最适宜PCR扩增体系扩增12枚小鼠孤雌胚，结果无一出现特异扩增带，鉴定准确率为100％。对随机抽取的小鼠8一细胞期、16一细胞期、桑椹期以及囊胚期胚胎进行PCR检测，阳性胚胎率分别为13．3％、36．7％、46．7％和43．3％，与50％的理论值相比较，除第一组外(p<0．05)，差异均

4、不显著(p>0．05)。本实验K建立的PCR扩增体系对于16一细胞期以后(包括16一细胞期)小鼠胚胎的性别鉴定具有较高的可信度，但还不能完全对早于8一细胞期(包括8一细胞期)的胚胎进行PCR检测。因此，今后工作的重点应放在完善实验条件、提高PCR扩增体系对超微量DNA模板的扩增能力即检测灵敏度等方面。关键词：性别鉴定小鼠早期胚胎PCRu一～。⋯ⅧⅣ⋯、n一一十～“塑垡些望堕竺竺墅坚SexDiscriminationOnMouseEmbryosinEarlyStagebyPCRGaoSongCollegeofAnimalScienc

5、e＆Technology,SouthwestAgricuhuralUniversity,ChongQjng,400716,ChinaAbstractInthisexperiment，threepairsofPCRprimersspecialrespectivelytomouse，humanandbox’inewereschemedoutaccordingtotheanalysisonthecoresequencesofSRY／Srygenesofthosemammalspecies．TheratesofamplifyingSryo

6、fmousewhitebloodcellswererespectively96．7％、86．7％and26．7％，andthetwoformersdonotdiffer(p>0．05)，butdofromthelastone(p<0．05)．Thepairofprimerswiththebestresultwasthefirstonespecialtothemouse，whosesequenceswere5’GGCTACTTACGGAAGTACCAC3’(Srylland5’GCCTATGAAGAGCGCCACGTC3’(Sry2

7、)．ThispairofprimerswereusedtoamplifySrygeneofwhitebloodcellsofmalemicewithdensityofMg”respectivelyas10mmol／L、15mmol／L、25mmol／Land30mmol／L，、vitllthematingratesbeing30％、60％、100％and100％，andthetwoformersareobviouslylowerthanthelasttwoones(p‘0．05)．Thenumbersofcyclingwerede

8、signedrespectivelyas25、36and50，withalmostthesanleresultsemerging，butthebestonewas36．TheproductofPCRwasexaminedtohave192bps，9