17 替米考星检测细则

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福建森宝食品集团股份有限公司企业标准Q/JCWI0217—2013动物性食品中替米考星药物残留检测酶联免疫吸附法2013-08-01发布2013-08-01实施福建森宝食品集团股份有限公司发布

1Q/JCWI0217—2013前言本标准按照GB/T1.1《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草本标准由公司检测中心提出并审核本标准起草单位：检测中心本标准起草人：张丽丽本标准批准人：黄金兰本标准于2013年8月1日首次发布。I

2Q/JCWI0217—2013修改履历表章节修改人修改日期版本修改内容或记录号批准人实施日期条款（起草人）（发布日期）A/0全新发布张丽丽黄金兰2013.8.12013.8.1II

3Q/JCWI0217—2013动物性食品中替米考星药物残留检测酶联免疫吸附法1范围本标准规定了动物可食性组织中替米考星药物残留量，酶联免疫检测方法的制样和检测方法.本标准适用于猪肌肉、鸡肌肉替米考星药物残留量的测定。2试验原理本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的替米考星与微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗替米考星抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含替米考星的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样本中替米考星的残留量。3交叉反应率替米考星……………………………………………100%泰乐菌素…………………………………………小于0.1%4设备及试剂以下所用材料，除特别注明者外，均为分析纯；水为符合GB/T6682规定的二级水。4.1设备┅┅微孔板酶标仪450/630nm┅┅旋转蒸发仪/氮气吹干装置┅┅均质器┅┅振荡器┅┅涡旋仪┅┅离心机┅┅天平：感量0.01g┅┅刻度移液管：10ml┅┅洗耳球┅┅容量瓶：100ml、500ml┅┅玻璃试管：15ml┅┅聚苯乙烯离心管：50ml1

4Q/JCWI0217—2013┅┅微量移液器：单道20～200l、100～1000l多道250l4.2试剂┅┅无水碳酸钠（分析纯）┅┅碳酸氢钠（分析纯）┅┅甲醇（分析纯）┅┅乙酸乙酯（分析纯）┅┅去离子水5试剂盒提供的材料与试剂96孔酶标板×1块（包被有偶联抗原）标准品×6瓶：（1ml/瓶）0ppb，0.5ppb，1.5ppb，4.5ppb，13.5ppb，40.5ppb高浓度标准品：（1ml/瓶）1ppm酶标二抗7ml抗体工作液7ml底物液A液7ml底物液B液7ml终止液7ml20×浓缩洗涤液40ml14×浓缩复溶液50ml6溶液的配制配液1:0.1M(PH=10.6)CB缓冲液称取0.932g无水碳酸钠、0.1g碳酸氢钠加100ml去离子水溶解混匀。配液2:复溶工作液用去离子水将4×浓缩复溶液按1：3体积比进行稀释（1份4×浓缩复溶液+3份去离子水）用于样本的复溶，复溶工作液在4℃环境可保存一个月。配液3:洗涤工作液用去离子水将20×浓缩洗涤液按1：19体积比进行稀释（1份20×浓缩洗涤液+19份去离子水）用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4℃环境可保存一个月。7样本前处理步骤7.1处理任何样本时，都必须注意：a)实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。b）实验之前须检查各种实验器具是否洁净，必须使用洁净实验器具，以避免污染干扰实验结果。7.2样本前处理方法2

5Q/JCWI0217—2013┅┅称取2.0±0.05g样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入2ml0.1M（PH=10.6）CB(见配液1)，再加入8ml乙酸乙酯，用涡动仪涡动3-5min，3000g以上，室温（20-25oC/68-77℉）离心5min；┅┅取4ml上层有机相至10ml洁净干燥玻璃试管中，于50-60℃（122-140℉）水浴氮气流下吹干；┅┅加入1ml正已烷，用涡旋仪涡动30s，再加入1ml复溶工作液(见配液2)，用涡旋仪涡动30s，3000g以上，室温（20-25oC/68-77℉）离心5min；┅┅除去上层，取下层50μl用于分析。8检测步骤8.1测定前应须知：测定前应须知：1、使用之前将所有试剂和需用板条的温度回升至室温（20-25℃/68-77℉）。2、使用之后立即将所有试剂放回2-8℃（36-46℉）。3、在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。4、在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜封住微孔板。8.2操作步骤：8.2.1将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20-25℃/68-77℉）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。8.2.2取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃（36-46℉）。8.2.3浓缩复溶液和浓缩洗涤液在使用前也需回温。8.2.4编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。8.2.5加标准品/样本、酶标二抗和抗体工作液：加标准品/样本50l到对应的微孔中，再加入酶标二抗50l/孔，最后加入抗体工作液50l/孔轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃（77.0℉）避光环境中反应30min。8.2.6洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液（见配液3）250l/孔，充分洗涤4－5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破）。8.2.7显色：加入底物液A液50l/孔，再加底物液B液50l/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃（77.0℉）避光环境中反应15min。8.2.8测定：加入终止液50l/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，请在5min内读完数据），测定每孔OD值。(若无酶标仪，则不加终止液用目测法可进行判定)。9结果判定结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光度值与其所含替米考星量的含量成负相关。3

6Q/JCWI0217—20139.1用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ppb)。假设样本1的吸光度值为0.113，样本2的吸光度值为0.554，标准品吸光度值分别是：0ppb为1.787；0.5ppb为1.215；1.5ppb为0.682；4.5ppb为0.332；13.5ppb为0.132；40.5ppb为0.056。则样本1的浓度范围是13.5ppb-40.5ppb再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中替米考星残留的浓度范围；样本2的浓度范围是1.5ppb-4.5ppb再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中替米考星残留的浓度范围。9.2定量测定9.2.1百分吸光率的计算,标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的平均吸光度值（双孔）除以第一个标准（0标准）的平均吸光度值,再乘以100%，即百分吸光率（%）=B×100%B0B—标准品或样本溶液的平均吸光度值B0—0ppb标准溶液的平均吸光度值9.2.2标准曲线的绘制与计算以标准品百分吸光率为纵坐标，以替米考星标准品浓度（ppb）的对数为横坐标,绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中替米考星实际浓度。样本稀释倍数猪肉、鸡肉、牛肉、羊肉、鱼、虾样本稀释倍数：1倍检测方法灵敏度、准确度、精密度试剂盒灵敏度：0.5ppb10检测方法灵敏度、准确度、精密度样本最低检测限：猪肉、鸡肉、牛肉、羊肉…………………0.5ppb准确度：猪肉、鸡肉、牛肉、羊肉………………80%±15%试剂盒的板内、板间变异系数均小于10%。11注意事项11.1室温低于20℃（68℉）或试剂及样本没有回到室温（20-25℃/68-77℉）会导致所有标准的OD值偏低。11.2在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。11.3每加一种试剂前需要将其摇匀。11.4反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。11.5不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。4

7Q/JCWI0217—201311.6储存条件11.7保存试剂盒于2-8℃（36-46℉），不要冷冻，将不用的微孔板放进自封袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。11.8试剂变质的迹象11.9发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。0标准的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5）时，表示试剂可能变质。11.10在加入底物液A液和底物液B液后，一般显色15min即可。若颜色较浅，可延长反应时间到20min（或更长），但不得超过25min。反之，则减短反应时间。11.11该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化会直接影响检测结果。12贮藏条件及保存期贮藏条件：保存试剂盒于2-8℃(36-46℉)环境中。保存期：该产品有效期为12个月。_________________________________5