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1、第24卷第5期西安交通大学学报(医学版)Vol.24No.52003年10月JournalofXi'anJiaotongUniversity(MedicalSciences)Oct.2003◇技术方法◇大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及其形态观察康新勤1,臧伟进1,宋土生2,于晓江1,曾菊绒1(西安交通大学医学院:1.心血管生理药理研究室;2.生物学教研室,陕西西安710061)摘要:目的分离和培养大鼠骨髓组织中的间充质干细胞,并观察其生长形态。方法利用造血干细胞和骨髓间充质干细胞不同生长特性,采用贴壁法分离并用含15%(体积分数)FBS的低糖型DMEM培养基培养。结果分离培养得到的细胞中随着换
2、液次数的增加红细胞和造血细胞逐渐减少;骨髓组织中贴壁得到间充质干细胞呈梭形、纺锤形和多角形。结论贴壁法可以分离培养骨髓中的间充质干细胞。关键词:骨髓间充质干细胞;分离;培养中图分类号:R329.2文献标识码:B文章编号:1671-8259(2003)05-0518-021999年《Science》杂志将干细胞研究列为当年十大科学2结果研究之首。干细胞研究已成为生命科学的一个主攻热点。骨髓中至少包含两种干细胞成分---骨髓间充质干细胞和骨髓接种骨髓的培养板24h后镜下观察发现细胞浓度极大,造血干细胞。现在的研究揭示骨髓间充质干细胞有分化成多全为球形的大鼠骨髓中的血红细胞,如堆积的沙粒状,悬浮于
3、种细胞的潜能[1],包括心肌细胞[2]、肝细胞[3]、脑中的神经细培养液中并有少量血红细胞相互聚集发生;连续3d换液后观胞和非神经细胞[4]、内皮细胞、成骨细胞和肺泡上皮细胞[5]察发现悬浮于培养液中的红细胞大量减少,塑料培养孔底部等。研究骨髓细胞的分化潜能,首先要分离骨髓中的间充质有少量的贴壁细胞,呈梭形、纺锤形和多角形;培养7d后培养干细胞。本文根据骨髓中造血细胞和间充质干细胞的不同生液中悬浮的细胞已完全除去,只留下贴壁的细胞,并且贴壁细长方式,采用一种较简单的分离方法,并观察了大鼠骨髓间充胞数量明显增加。对比每个培养孔不同区域细胞分布发现,质干细胞的生长形态。培养孔边沿部分细胞密集,形
4、态有梭形、纺锤形和多角形(图1)。相对中央部分,位于培养孔边沿的细胞长势好而且细胞1材料和方法体积大,即出现“细胞边集现象”。培养14d观察发现,细胞已1.1实验材料Sprague-Dawley(SD)大鼠由本校实验动物基本上长满整个培养孔(图2)。中心提供;低糖型DMEM培养基购自GIBCO公司;胎牛血清3讨论(FBS)购自杭州四季青犊牛研究所;青霉素和链霉素购自市售的华北制药有限责任公司。15%(体积分数)FBS的骨髓中含有多种细胞,包括基质细胞、血管细胞、脂肪细DMEM细胞培养基由15%(体积分数)FBS、DMEM培养基、胞、成骨细胞、破骨细胞、造血干细胞和间充质干细胞。以前-1青霉素
5、及100IU·mL-1链霉素组成。认为骨髓中细胞的功能只是骨髓内细胞再生和再生循环血细100IU·mL1.2方法取1月龄SD大鼠1只,雌性,体重88g。用木棒胞。现在的研究揭示骨髓干细胞有分化成多种细胞的潜能。敲击头部处死。取股骨和胫骨,注意保留骨端部分不受损伤。骨髓干细胞将有可能成为治疗遗传病或变性性疾病的理想来用75%(体积分数)酒精浸泡15min后移入超净工作台中。源细胞。1968年,Fridenstein等提出了在骨髓中存在能贴附放置于干净的培养皿内晾干,剪去骨头两端,露出骨髓腔。用塑料培养皿,呈长棱形成纤维细胞样的细胞,培养时呈克隆生含15%(体积分数)FBS的DMEM培养液冲洗骨
6、髓腔,反复2长,能形成CFU-F(colonyformingunitsfibroblastic),这种细次。含有骨髓细胞的培养液经打匀后接种于6孔培养板中的胞具有多向分化潜能,称这类细胞为骨髓间充质干细胞(mes-3孔。于接种培养24h后换液,并将换取的培养液移入另外3enchymalstemcells,MSCs)、骨髓间质干细胞,也称骨髓基质孔,于接种后48h后换液。从而形成0～24h贴壁细胞和24干细胞(marrowstromalstemcells,MSSCs)。1869年Gou-～48h贴壁细胞各3孔。以后每天换液,连续3d。3d后改jon观察到自体红骨髓异位移植后具有成骨作用。MSC
7、s是为每隔2d换液。每天观察细胞形态并作记录。存在于骨髓中非造血干细胞的另一种干细胞,具有多向分化潜能,不仅能分化为造血实质支持造血,还可分化为多种造血收稿日期:2003-03-25修回日期:2003-05-10以外的组织细胞。特别是中胚层和神经外胚层来源的组织细基金项目:国家自然科学基金(No.30270554);教育部科学技术重点胞。在实验条件控制下能分化成肌细胞、成骨细胞、脂肪细项目(No.01161)
