DB21∕T 3638-2022 海蜇种质鉴定技术规范(辽宁省)

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ICS65.150CCSB50/59DB21辽宁省地方标准DB21/T3638—2022海蜇种质鉴定技术规范TechnicalRegulationforGermplasmidentificationofRhopilemaesculentum2022-10-30发布2022-11-30实施辽宁省市场监督管理局发布

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2DB21/T3638—2022前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及某些专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由辽宁省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：辽宁省海洋水产科学研究院。本文件主要起草人：李云峰、李玉龙、周遵春、鲍相渤、陈百灵、陈井童、田梅琳。本文件发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈，我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅（沈阳市和平区太原北街2号），联系电话：024-23447862。文件起草单位通讯地址：辽宁省海洋水产科学研究院（大连市沙河口区黑石礁街50号），联系电话：0411—84697003。I

3DB21/T3638—2022海蜇种质鉴定技术规范1范围本文件规定了海蜇（Rhopilemaesculentum）的学名与分类、鉴定方法和判定规则。本文件适用于海蜇种质检测和鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T18654.2养殖鱼类种质检验第2部分：抽样方法GB/T18654.12养殖鱼类种质检验第12部分：染色体组型分析3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4学名与分类4.1学名海蜇Rhopilemaesculentum（Kishinouye,1891）。4.2分类刺胞动物门（Cnidaria）、钵水母纲（Scyphomedusae）、根口水母目（Rhizostomeae）、根口水母科（Rhizostomatidae）、海蜇属（Rhopilema）。5鉴定方法5.1抽样按GB/T18654.2规定执行。5.2形态特征在自然光下进行观察记录，体形呈蘑菇状，分为伞体部和口腕部，伞体部和口腕部之间，由胃柱、胃膜、口柱连为一体。伞体部表面光滑，呈半球形，伞体部边缘有8个感觉器，将伞缘平分成为8个区，每个区有14个~22个缘瓣，呈舌状。生殖下穴外侧的内伞部表面有4个生殖乳突，口柱基部具有8对肩板，每个肩板左右扁平，为三翼形。口腕部具有8条口腕，呈三翼型，口腕上具有丝状附属器和棒状附属器。海蜇外形及纵切面图见图1。1

4DB21/T3638—2022图1.海蜇外形及纵切面图1.中胶层；2.胃腔；3.生殖下穴；4.间辐管；5.肩板；6.口腕管；7.外伞；8.生殖乳突；9.生殖腺；10.胃丝；11.内伞；12.感觉器；13.缘瓣；14.口腕；15.丝状附属器；16.棒状附属器5.3繁殖5.3.1性成熟海蜇雌雄异体，雄性和雌性性成熟年龄为1龄。5.3.2怀卵量67怀卵量随个体的增大而增加，每个雌性海蜇一生的怀卵量为2.0×10粒~8.0×10粒。在显微镜下观察性腺发育情况，当卵子直径在80μm~100μm可进行繁殖，统计每个雌性海蜇的怀卵量。5.3.3产卵类型海蜇分批产卵，卵为沉性卵，卵径80μm~100μm，产卵2批~3批，产卵时间在8月~10月。5.3.4繁殖特性世代交替生殖，水母型通过有性生殖产生无性世代水螅型，水螅型通过横裂生殖产生有性世代水母型。5.4细胞遗传学特性检测5.4.1染色体数体细胞染色体数：2n=42。5.4.2核型染色体组核型公式：10m+14sm+12st+6t，NF=78。染色体核型见图2。2

5DB21/T3638—2022图2.染色体核型5.4.3染色体标本的制备按照附录A的规定执行。5.4.4染色体数目及核型分析按照GB/T18654.12执行。5.5分子遗传学特征5.5.1DNA提取取海蜇口腕部200mg，用DNA提取试剂盒或CTAB法进行提取。5.5.2COI基因的引物序列正向引物(F)：GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG；反向引物(R)：TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA。5.5.3反应条件PCR反应液见附录B表B.1。反应条件为：94℃预变性5min；进入30个循环，每个循环94℃变性30s，53℃~56℃退火30s，72℃延伸30s；最后72℃延伸5min。5.5.4COI基因序列测序PCR产物纯化后克隆进行测序。COI基因片段序列如下：长度为620bpACTGATACACTGATTGACGTACTGACAATCTGATTGTCTGTCGTCTGTCGCTTGCTTGTGCAGCAGCTTATGCAGCAGCTGACACAACACGACCACTGTGAACTTGTACCATCCGTGTGAGGTGGACAGAGCTGCGTGTGTCTGTCCTTGCATGAAGAGCACCTCCCTCGTGTGTCTATCTCTTCGGCCTCACATTGGAGCTATTTTGTTGGTTGTTTTTGCTGCCATTTTTAACACGTTATTATATTATACAAATTGTTGCT3

6DB21/T3638—2022GCACACGCACCAGAAGAGACGTTCGCTCGTTCGCTCGTTCGTTTGTCTCTTGCTGTATACGTGTGGCTAGCGATAAAACAAAACAAACCAAGAAACAACTTCCAACGGTGGATCTCTTGGCTCGTGCATCGATGAAGAACGCAGCCAGCTGCGATATGTAGTGTGAATTGCAGAACCCAGCGAATCATCGAATCTTTGAACGCAAATGGCGCTCCTTGGTTCTCCATGGAGCACGTCTGTCTGAGCGTCATGGCCAATCAATCCCAATAGCACACGCTCTTCTGCAAAGAGAGGAGCATGTGGCGTTGAGGCAACACGGCGTTGATGACGGACATCAGCCATCAACTGATGTCTGTC6判断规则符合第5章要求，且COI基因序列测序结果与5.5.4节比对结果相似度在98%以上，判定为该种。4

7DB21/T3638—2022附录A(规范性）染色体标本的制备方法A.1秋水仙素处理：将发育至囊胚期的胚胎细胞收集于10ml管内，加入终浓度为0.4g/L的秋水仙素（无菌海水配置）于24℃处理45min。A.2低渗：将细胞悬液于1000rpm/min离心10min，去除上清后加入0.075mol/L的KCl溶液，27℃低渗45min。A.3固定：去上清后，加入-20℃冰箱中预冷的现配置的卡诺固定液（甲醇：冰醋酸=3:1）固定3次，每次15min，后置于-20℃中过夜处理。A.4解离：-20℃中取出已经固定好的细胞悬液，离心去上清，加入预冷的50%冰醋酸1-2滴进行解离后，加入-20℃预冷的新配置的卡诺固定液。A.5滴片：将细胞悬液在距冰冻载玻片上1m左右的高度滴下，酒精灯火焰干燥。A.6染色：将载玻片置于现配置的10%Giemsa（pH=6.8）染缸内染色30min，用蒸馏水冲洗干净，或将载玻片用DAPI染色，封片，染色24h，-20℃保存。A.7观察：将染色体标本在100倍油镜下检测观察。5

8DB21/T3638—2022附录B(规范性）PCR扩增反应液PCR扩增反应液配方见表B.1。表B.1PCR扩增反应液配方反应体系含量DNA模板50ng～100ng10XPCR缓冲液2.5µLMgCl2(25mmol/L)2.0µLdNTP(10mmol/L)0.5µL引物F(50pmol/µL)0.5µL引物R(50pmol/µL)0.5µLTaq聚合酶(5U/µl)0.2µL超纯水18µL_________________________________6