羟基磷灰石纳米粒子体外抗肝癌的实验研究

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1、羟基磷灰石纳米粒子体外抗肝癌的实验研究 　　肝癌严重危害人类的健康，目前大多数化疗药物疗效虽然快但不理想，而且副作用大，因此，临床应用受到限制。羟基磷灰石（HAP）纳米粒子具有良好的生物相容性、生物活性、化学稳定性及广谱抑癌作用[1～3]，但对正常细胞的影响研究较少。我们的实验旨在研究HAP纳米粒子对肝癌细胞及肝细胞的选择性作用，探讨应用于肝癌临床治疗的可能性。 1　材料和方法 1.1　试剂及仪器DMEM(Gibco)；新生牛血清(Gibco)；Ⅳ型胶原酶(Gibco)。倒置显微镜(CK_40Olympus,Japan)；酶标检测仪(MB_Ⅲ，北京市新技术

2、应用研究所)；粒径分析仪(Zataplus，Brookhaven)；透射电镜(H_600Hitachi,Japan)。1.2　细胞株及动物　　细胞系Bel_7402人肝癌细胞来源于中国科学院上海细胞研究所细胞库，由武汉大学典型培养物保藏中心提供。　　Wistar大鼠，雄性，SPF级，体重260g～300g，由湖北省医学科学院医学实验动物中心供给，合格证号：19—084。1.3　实验方法1.3.1　HAP纳米粒子制备与检测　　以Ca(OH)2饱和液和Ca(H2PO4)2为原料，应用均相沉淀法制备HAP纳米粒子。高压灭菌，临用前用DMEM培养液稀释，终浓度为1

3、.4×10－4mol/L、1.4×10－5mol/L、1.4×10－6mol/L三组。常规制备透射电镜(TEM)标本，镜下观察HAP纳米粒子形状、大小及分散状态。1.3.2　实验分组及细胞培养　　肝癌细胞分4组：C、C1、C2、C3，其中C为空白对照组，C1～C3分别含有1.4×10－4mol/L、1.4×10－5mol/L、1.4×10－6mol/LHAP纳米粒子组。肝细胞分组同上，与其对应的为N、N1、N2、N3。　　对数生长期的肝癌细胞经0.25％胰酶消化，用DMEM培养基(含10％小牛血清、10万U/ml青霉素、10万μg/ml链霉素)配成单细胞悬

4、液，以2×104个细胞/ml接种于25ml培养瓶内，计40瓶。肝细胞的分离依据文献[4]进行，以上述同样方法配制肝细胞悬液，接种40瓶。将全部培养瓶置37℃、5％CO2下培养，24小时后更换培养液，给药组换含不同浓度HAP纳米粒子的培养液，对照组加等量新鲜培养液，继续培养5天，实验重复3次。1.3.3　形态学观察及活细胞计数　　在培养状态下，用倒置显微镜每日观察细胞生长状况和形态学改变。　　每天每组取2瓶，经0.25％的胰酶消化后，取30μl细胞悬液加2％台盼蓝染液混匀，在细胞计数板上计数，每瓶计数3次，取其平均值，拒染细胞为活细胞。统计结果行t检验。 2

5、　结　果 2.1　HAP纳米粒子的大小、形态　　透射电镜下观察HAP纳米粒子呈均匀分散的针状颗粒，平均粒径67.6nm，粒径分析仪测定有效平均粒径为72.3nm。2.2　细胞形态学变化　　培养细胞在倒置显微镜下观察，肝癌细胞呈典型的多边形贴壁生长。培养5天连续观察到C组Bel_7402细胞增殖明显，细胞数量逐渐增多，第4天达高峰(见图1)。用HAP纳米粒子处理的C1组，24小时内细胞形态、数量没有明显变化，随着培养时间的延长细胞数量逐渐减少，部分细胞变成圆形、梭形或不规则形，于第4天细胞质内形成大量空泡(见图2)，多形性更加明显。C2组、C3组与C组比较没

6、有明显差异。　　新鲜分离的肝细胞呈单个分散状态，为具有立体感的圆球形，晶莹透亮，体积上大小一致。培养24小时后细胞单层铺展，圆形或多边形。N组细胞数始终呈上升趋势；N1、N2、N3组未见细胞形态、数量的显著变化。2.3　HAP纳米粒子对细胞生长的影响　　高浓度的HAP纳米粒子与2×104细胞/ml共同孵育后，肝癌细胞的生长受到抑制，与对照组相比P<0.01，且该作用随HAP纳米粒子作用时间的延长而增强。而对正常肝细胞的抑制作用较弱。如图3所示。 3　讨　论　　　　原发性肝细胞癌是常见的恶性肿瘤，涉及细胞生长、分化与凋亡之间的调控失衡，以及环境与机体的相互作

7、用[5]。肝癌的发病率高，而且还具有极强的临床侵袭性，预后极差。许多抗肝癌的化学药物通过不同的机制作用于肝癌细胞，但其疗效不佳，相互之间可产生交叉耐药性，并增加毒副作用。　　无机纳米粒子在抗肿瘤方面初步显示了独特的优势。纳米粒子通常是指尺度在1nm～100nm之间的微粒，由于其具有大的比表面积，表面原子数、表面能和表面张力随粒径的下降急剧增加，表现出了小尺寸效应、表面效应及很强的吸附性和生物活性。纳米粒子的抗肿瘤效应分为两类：其一，纳米粒子—药物复合物，纳米粒子在其中承担载体的作用[6];其二，单纯纳米粒子，主要发挥纳米粒子本身的抗肿瘤效应。我们研制的HA

8、P纳米粒子，平均粒径67.6nm，利用其本身独特的生物活性进行了初