手工克隆小鼠胚胎的研究

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1、HeilongjiangJournalofAnimalＲeproductionVol.22No.62014手工克隆小鼠胚胎的研究1，2111，21111，2陈玉，李杏，张海平，GáborVajta，陈文彬，刘杰，李林，杜玉涛(1.深圳华大方舟生物技术有限公司，广东深圳518083;2.深圳华大基因研究院，广东深圳518083)摘要:与传统克隆相比，手工克隆使用较为简单的仪器设备和技术操作即可生产克隆动物。小鼠作为模式实验动物在多领域得以应用。本研究中采用杂交胎鼠细胞系提供核供体细胞，在含细胞松弛素(CytochalasinB，CB)和链蛋白酶(Pronase)及2%血清的M199h

2、epes缓冲液滴(CBMP)中消化透明带并切割去核，电融合后1h，重构胚置于含SrCl2及CB(5μg/mL)的无钙2+体外培养液(Ca－freeIVC)中激活6h，体外培养液(IVC)中清洗3遍后，移入WOW系统培养，培养至小鼠HMC囊胚阶段。研究发现:1)CBMP液中Pronase的浓度相比20μg/mL和100μg/mL，卵母细胞透明带在10μg/mL组需要更长时间消化至消失，较有利于操作;2)直流电(DC)80V，持续40μs，融合率达60%。3)含10mmol/LSrCl2的化学激活液处理的重构胚与5mmol/L组相比，囊胚更高(29±3%∶13±3%，P＜0.05)，差

3、异显著;4)两种体外培养液，CZB与mPZM，在IVC囊胚率上无显著差异(29±3%∶24±5%，P＞0.05)，而使用CZB可获得较高的囊胚率。本实验首次采用HMC方法体外条件下生产小鼠克隆胚胎，通过摸索透明带消化时间、电激活参数、化学激活试剂及培养液，尝试小鼠体外生产克隆胚胎的新方法，并取得了初步成果，技术优化及效率提高问题仍需要更进一步的研究。关键词:小鼠;HMC;透明带消化;电融合;化学激活;体外培养中图分类号:S814.3文献标识码:A文章编号:1005－2739(2014)06－0011－05众所周知，1997年首次获得的体细胞克的核切除，从而达到去核目的。手工克隆与［

4、1］隆绵羊是在显微操作仪器辅助下，通过显传统克隆相比，无需使用显微操作仪，仅使微操作技术(传统克隆)把供体核移入去除遗用较简单的仪器设备和技术要求即可生产克传物质的成熟卵母细胞中，新移入的细胞隆动物。至今，通过手工克隆技术，已经生［4］［5］［6］核，发生发育重编程过程，形成重构胚。在产出了猪、基因猪、转基因绵羊等哺获得克隆绵羊之后，黄牛、水牛、山羊、骡乳动物。子、马、猪、小鼠、大鼠、兔子、猫、狗等小鼠由于具有遗传背景清楚，繁殖周期多种克隆动物均通过显微操作技术相继问短，饲养成本较低，材料比较容易得到等优［2］世。点，成为一种广泛使用的模式实验动物［7，8］。2004年，Vajta

5、等人，利用手工克隆方第一只成纤维细胞克隆小鼠，由Wakayama［3］法成功获得了克隆牛。此方法是在体视显［9］等人在1998年获得。研究人员通过显微微镜下，手持特制刀片将无透明带卵母细胞操作直接将供体细胞注入去核卵母细胞，成收稿日期:2014－09－15功得到了来自颗粒细胞作为供体核的正常后作者简介:陈玉(1981－)，女，硕士，助理研究员。代，以及支持细胞和神经细胞作为供体核的—11—黑龙江动物繁殖第22卷第6期2014年［9］正常胎儿。AtsuoOgura等人，通过电融合需氨基酸(NEAA)，15%胎牛血清(FBS)配法，将供体细胞核注入卵周隙，加以一定强制成完全DMEM细胞

6、培养液。商品化PBS度电脉冲，使供体细胞核与去核卵母细胞胞粉末配制D－PBS。商品化0.05%胰蛋白酶质产生融合，成功获得小鼠尾尖细胞克隆小(Trypsin)。［9］鼠。Ｒ．Ｒibas等人，在2005年发表的文1.4卵母细胞采集章中，阐述了以钝头去核针和顶端封闭的分室温条件下，7～8周龄的KM雌鼠，每离管结合使用，去除无透明带卵母细胞细胞只空腹腔注射10IU的PMSG，48h后腹腔注核，经电融合构建重构胚，继而获得克隆小射10IUhCG。在注射hCG13h后，采用断［10］鼠的实验。颈椎法处死小鼠，并且剪下输卵管连接卵巢研究人员通过对卵母细胞透明带消化试段，转移至显微镜下，挑破输卵

7、管膨大部，剂、电激活参数、化学激活时间，以及培养收集卵丘卵母细胞复合体(COCs)。将COCs试剂的研究，初步建立了一套适合本实验室放入含有透明质酸酶(Hya)的M2滴中，卵运用的手工克隆技术及在体外条件下生产小丘细胞脱落后的卵母细胞在M2中洗涤3遍，鼠胚胎的实验流程，为转基因、胚胎干细转移至切割盘里的M2滴中。胞、模式动物克隆等研究提供材料。1.5核供体细胞准备1材料与方法核供体细胞系来自12.5d的CF－C胎1.1试剂鼠，由CF－1♂与C57♀杂交得到，来自本孕马