苹果茎痘病毒的ic_rt_pcr检测

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1、江苏农业科学2014年第42卷第5期—63—李丽丽，付耕云，杨洪一．苹果茎痘病毒的IC－ＲT－PCＲ检测［J］．江苏农业科学，2014，42(5):63－65．苹果茎痘病毒的IC－ＲT－PCＲ检测122李丽丽，付耕云，杨洪一(1．黑龙江省林业科学研究所，黑龙江哈尔滨150081;2．东北林业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨150040)摘要:利用CTAB缓冲液提取苹果叶片粗提液，以苹果茎痘病毒(ASPV)的抗血清包被薄壁管，捕获感病叶片粗提液中的ASPV病毒粒子;最终进行ＲT－PCＲ反应扩增ASPV特异片段，建立了利用免疫捕获ＲT－PC

2、Ｒ(IC－ＲT－PCＲ)技术检测ASPV的技术体系。结果显示，IC－ＲT－PCＲ可有效检测ASPV，且对栽培苹果、海棠、杏、毛樱桃样品的检测皆有效。IC－ＲT－PCＲ无需提取ＲNA，只需叶片粗提液，步骤简单;IC－ＲT－PCＲ技术受叶片中杂质影响较小，可有效检测不同植物样品中的ASPV，具有重要应用价值。关键词:苹果茎痘病毒;IC－ＲT－PCＲ;粗提液中图分类号:S436．611文献标志码:A文章编号:1002－1302(2014)05－0063－02苹果茎痘病毒(applestempittingvirus，ASPV)是一种严核酸纯度

3、低影响扩增的问题。基于IC－ＲT－PCＲ的优势，本重危害果树生产的潜隐性病毒，主要侵染苹果和梨，从而导致研究探索利用IC－ＲT－PCＲ技术检测ASPV，从而希望获得［1］苹果和梨产量降低、品质变差。ASPV最早于1954年在美一种可有效检测ASPV的技术体系。［1］国森林苹果(Malussylvestris)上被发现，目前在世界各地广1材料与方法泛分布。ASPV在一些敏感的砧木和栽培品种上症状较明显，主要表现为叶片反卷、木质部茎痘斑、果实凹陷、叶偏上性1．1植物材料［2］生长等。为了进一步控制病毒危害，迫切需要灵敏、快速苹果植株购自浙

4、江，海棠和杏样品取自吉林九台。35株的病毒检测技术，因此本研究探索了用于检测ASPV的IC－毛樱桃样品取自黑龙江省哈尔滨市，其中20株取自东北林业ＲT－PCＲ技术。生物学方法是最传统的植物病毒检测方法，大学校园，其他为哈尔滨街边绿化苗木。主要是将病毒转移到木本或草本指示植物上，通过病毒在敏1．2引物感的指示植物上显示一些典型症状来确定病毒的存在。刘福引物ASPV1、ASPV2序列分别为:5'－GAGCTCATAGGT-昌等利用生物学方法对我国苹果、梨受ASPV感染情况进行GCGTTCAATCAT－3'、5'－CTCGAGTCACTTC

5、CTGATGGATA-了大规模的病毒筛查，结果显示该方法可有效鉴定ASPV，其AA－3'，由TaKaＲa公司合成。［3］缺点是周期长、易受季节和环境等因素影响。基于基因组1．3总ＲNA提取［4］学的发展，国内外研究人员已获得ASPV的基因组序列，以取新鲜的植物叶片约0．05g，在液氮中迅速研磨，转入至此为基础，并进一步开始探索利用PCＲ技术进行病毒检测。1．5mL离心管中，再向离心管中加入490μLCTAB缓冲液和早在1998年Nemchinov等即开始探索利用ＲT－PCＲ技术检10μLβ－巯基乙醇，至振荡器上混匀，65℃恒温水浴10

6、min，［5］测ASPV并取得了成功。我国从20世纪末开始了苹果病其间上下颠倒离心管使混合溶液混匀;加入与混合液等体积毒的ＲT－PCＲ检测研究，侯义龙等首先探索建立了ASPV的的三氯甲烷/异戊醇(体积比为24∶1)，颠倒至均匀，ＲT－PCＲ检测体系，并对一些田间样本进行了小规模检12000r/min离心5min;弃沉淀，抽取上清液转移至新的［4，6］测。ＲT－PCＲ技术的缺点在于其稳定性较差，提取高质1．5mL离心管中，再次加入与上清液等体积的三氯甲烷/异量苹果、梨核酸较难，而核酸中的杂质影响DNA聚合酶的稳戊醇(24∶1)，混匀，1

7、2000r/min离心5min;弃沉淀，抽取上［7］定性，因而有较多PCＲ检测结果不稳定的报道。为了提高清至已加入2倍体积的无水乙醇的1．5mL离心管中，混匀，PCＲ反应的稳定性，一些基于PCＲ技术的新技术被开发并不12000r/min离心5min;弃上清，加入300μLTE溶解沉淀，断完善。免疫捕获ＲT－PCＲ(immunocaptureＲT－PCＲ，12000r/min离心5min;弃沉淀，吸上清液至新的1．5mL离IC－ＲT－PCＲ)是近年来新发展起来的一种联合血清学和分心管中，加入1/10体积的醋酸钠(NaAc，pH值=5．2

8、)、3倍体子生物学方法的检测技术。IC－ＲT－PCＲ首先利用抗血清积的无水乙醇，混匀，12000r/min离心5min;弃上清，加入捕获病毒粒子，再进行ＲT－PCＲ反应，解决了因病毒含量和50μL去离子水溶解，低温保存。