纯牛奶中动物水解蛋白l_羟脯氨酸含量测定

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1、质量2014·11/12安全QUALITY&SAFETY纯牛奶中动物水解蛋白L-羟脯氨酸含量测定由丹青（北京奶牛中心，北京 100192）中图分类号：TS252.7文献标识码：A文章编号：1004-4264（2014）11/12-0048-03摘要：为建立一种测定纯牛奶中L-羟脯氨酸的紫外分光光度法，本研究首先优化前处理条件，然后通过紫外分光光度计选出L-羟脯氨酸的最佳吸收波长，测定其含量，并进行精密度和加标回收率试验。结果显示，待测组分线性关系良好，最低检出限为0.2mg/kg。相对标准偏差RSD为0.48%~0.77%，加标回收率基本在93.13%~100.5

2、7%。本方法灵敏、准确，重复性好，样品处理简便易行，可用于纯牛奶中L-羟脯氨酸含量测定。关键词：动物水解蛋白；L-羟脯氨酸；紫外分光光度法将动物水解蛋白加入乳制品中，可以提高乳制品中酸破坏过量的氯胺T，羟脯氨酸氧化物与对二甲基苯甲[4]蛋白质的含量，由于此方法成本低，成为不法分子常用醛反应生成红色化合物，在最佳波长处测定吸光度。的掺假手段之一。动物水解蛋白是由动物皮革及其制品1材料与方法下脚料等水解得到的蛋白质，由于下脚料中含有重铬酸钾和重铬酸钠，因此用这种原料生产水解蛋白，重铬酸1.1仪器[1]钾和重铬酸钠会带入产品中，被人体摄入。这些物质UV2550型紫外可见

3、光分光光度计（岛津仪器有限在体内无法分解，缓慢积累会导致中毒，对人体危害极公司）；AUY220型电子天平（岛津仪器有限公司）；大。所以国家禁止在乳及乳制品中添加皮革水解蛋白。HWS12型电热恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司）；L-羟脯氨酸（L-Hydroxyproline）是动物胶原水DL-201BS电热恒温干燥箱（天津市中环实验电炉有限解蛋白的主要成分之一，一是胶原中的特征氨基酸，其公司）。[2]含量是衡量动物胶原水解蛋白含量的一个重要指标。1.2试剂本试验之所以设计为检测纯牛奶中是否含有L-羟脯氨结晶乙酸钠、苯酚、柠檬酸、对二甲基苯甲醛、氯酸，是因其为动物胶原

4、蛋白中特有成分，而不存在于乳胺T（国药集团化学试剂有限公司）；正丙醇（永大化酪蛋白中，所以一旦检出，则可认为纯牛奶中含有皮革学试剂有限公司）；高氯酸（金鹿化工有限公司）；盐[1]水解蛋白。酸、氢氧化钠（北京北化精细化学品有限责任公司）；目前，检测乳制品中是否添加动物水解蛋白的方法异丙醇（Fisher.Scientific）；所用试剂均为分析纯，水大致可以分为三种：一是直接检测动物水解蛋白；二是为蒸馏水。用石墨炉原子法检测皮革奶中含有的重金属铬(Ⅵ)；三L-羟脯氨酸标准品（L-Hydroxyproline，[3]是检测动物水解蛋白中特有的L-羟脯氨酸。其中比色111

5、578-200201）购于中国药品生物制品检定所。法测定L-羟脯氨酸相较于其他方法不需要衍生，简单有氢氧化钠溶液：称取10g氢氧化钠，溶于水中，定效，准确度高，检测成本低，是目前应用较广的一种方容至250mL，配成1mol/L氢氧化钠溶液；称取100g氢法。其检测原理是：样品经酸水解，释放出L-羟脯氨氧化钠，溶于水中，定容至250mL，配成10mol/L氢氧酸，经氯胺T氧化，生成含有吡咯环的氧化物，用高氯化钠溶液。收稿日期：2014-03-04缓冲液：将50g柠檬酸、26.3g氢氧化钠和146.1g48质量2014·11/12QUALITY&SAFETY安全结晶乙

6、酸钠溶于水，稀释至1L，此溶液与200mL水和光度；ρ为标准曲线查得试样吸光度对应浓度（μg/300mL正丙醇混合。mL）；M为标准曲线斜率；X为样品中L-羟脯氨酸的百氯胺T溶液：将1.41g氯胺T，溶于10mL水中，依分含量（mg/kg）；V1为水解后定容体积（mL）；V2为次加入10mL正丙醇和80mL缓冲液。调节pH值时取用液体体积（mL）；V3为调节pH值后定显色液：称取10g对二甲基苯甲醛，用35mL高氯容体积（mL）；m为称取试样的质量（g）。酸溶解，缓慢加入65mL异丙醇。1.7精密度检测L-羟脯氨酸标准储备液（500μg/mL）：称取取一份纯牛奶样

7、品，添加两个不同水平浓度的L-50.0mgL-羟脯氨酸用少量水溶解，加一滴6mol/L盐羟脯氨酸标准溶液，进行精密度试验，重复测定6次，酸，定容至100mL容量瓶中。比较每次测定数据之间的差异，并计算6次测定值之间L-羟脯氨酸标准工作液（5μg/mL）：吸取标准储的相对标准偏差，评估精密度。备液5.00mL于500mL容量瓶中，定容。1.8回收率检验1.3样品前处理称取已知含量的同一样品5份，其中2份测定本底称取5g（精确到0.1mg）样品置于15mL水解瓶值，另外3份加入一定浓度的L-羟脯氨酸标准溶液，处中，加12mol/mL盐酸5.00mL，加入50g/L的重

8、精馏苯理后