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1、ELISPOT技术在免疫学领域中,对于疾病以及疫苗研究不仅仅局限于体液免疫应答,细胞介导的免疫应答(cellmediatedimmuneresponse,CMI)也是人们所关注的,而T细胞在CMI中起关键作用。在研究细胞免疫应答保护作用及其机理方面,有多种研究方法可以使用，如：ELISA（酶标记免疫附测定法，enzyme-linkedimmunosorbentassay）、流式细胞分析术（flowcytometry）、定量RT-PCR以及这里要介绍的近年使用越来越多的ELISPOT。作为一项新型的免疫酶技术——酶联免疫斑点法(enzymelinked
2、immunospotassay,ELISPOT),是从单细胞水平检测分泌抗体细胞(ASC)或分泌细胞因子(CK)细胞的一项细胞免疫学检测技术。由于该方法敏感性高,易操作,成本相对流式细胞分析术也较低，已被广泛用于分泌CK细胞检测或ASC测定中。下面将从原理、具体实验操作、技术优势和应用几方面进行介绍。原理ELISPOT就其原理来说实在是很简单的，从本质上说和ELISA的原理是一样的，理解起来并不难，关于ELISA的工作原理可看酶联免疫吸附实验（ELISA）【1】。传统的ELISA与ELISPOT都是根据酶免疫学检测原理,通过酶的高催化频率,放大反应效
3、果,从而达到很高敏感度的检测效果。如图所示，反应步骤可大致分为：1.利用特定细胞因子的单克隆抗体包被96孔板，封闭剩余的空白位点2.加入细胞悬液，用特异性抗原刺激、活化细胞，产生细胞因子，细胞因子会往附近扩散与之前包被的抗体进行特异结合3.洗掉细胞4.加入酶标二抗特异与细胞因子进行结合，通过底物的显色反应，一个细胞所在位置就会显出斑点，最后利用显微镜或者特定的读板机（reader）就可以计算出样品中被激活细胞的数目以上是检测分泌细胞因子细胞的流程，如果是检测分泌特异抗体的细胞只需把包被特异抗体变为包被特异抗原即可。具体实验操作从原理上看ELISPOT
4、的确很简单，但是在操作过程中有许多条件需要摸索，所以这里进一步介绍一下ELISPOT的操作步骤。I.将适量捕获性抗体预先包被于96孔ELISPOT板上,用胶带封板并在4℃孵育过夜。将板用PBS洗6遍,再用含体积比10%胎牛血清(FCS)的培养基封闭,室温下孵育至少1h。FCS可以封闭所包被抗体的FCS受体以降低非特异性反应。有一种特殊的96孔板底面介质是PVDF膜，利用膜的多孔结构可以让单个细胞坐到其中，然后分泌细胞因子或特定抗体，这样使最后的检测单个细胞灵敏度成为可能。同时，PVDF膜的不透光性也是ELISPOT与ELISA的不同之处。理论上是可以
5、同时包被两个不同的抗体的，两种不同的抗体可以利用不同的显色系统显出不同颜色，但是这样就要考虑到不同抗体间的不亲和性，必需保证每种抗体包被的数量要足够。如果是使用试剂盒的预包被板，这一步就可以省略啦。II.将阴性对照和细胞样品,如外周血单核细胞(peripheralblood+mononuclearcell,PBMC),经纯化的CD8T细胞或去除某种特异细胞群的45PBMC,用含10%FCS的培养基稀释至5×10～2×10个/孔如果条件可以达55到更高的细胞数，建议可以尝试3×10～5×10个/孔，特别是在分泌细胞）,分装于ELISPOT板孔中,再加入
6、特异的刺激物,如多肽或基因表达产物,提取的抗原等,阴性对照孔中只加入培养基（实验中最好采用无血清的培养基，这样可以避免因为血清批次不同的差异所造成的误差，同时也避免血清的某些成份会引起非特异的反应）,阳性对照孔加入植物血凝素2(PHA,2μg/mL)或阳性多肽,37℃,体积比为5%CO培养24～48h。要进行ELISPOT实验的细胞必需制备成为悬液的形式。利用ELISPOT的检测是十分-12灵敏的，频率低至10的分泌细胞都可以被检测出来。并且对于那些会贴壁的细胞也可以使用此种方法，虽然细胞生长贴壁后不易被洗去，但是不会妨碍最后斑点的显色。只要细胞可以
7、正常分泌与抗体特异结合的产物，这些产物会逐步扩散到细胞四周，最后还是可以显示出斑点。III.用含体积比0.01%Tween-20的PBS洗6次,以弃去细胞,加入生物素化抗细胞因子的检测抗体,孵育3h。再洗6次后,加入AP或HRP标记的链亲和素,室温孵育3h。IV.用PBS-Tween-20再洗5次,加入底物室温下显色,待出现紫色(AKP和底物的产物)或红色(HRP和底物的产物)斑点时,即可用立体解剖显微镜或计算机辅助成像分析系统计算斑点数,并用斑点形成单位(sfu/L百万加入细胞)记录结果。每一个斑点代表一个特异分泌CK的细胞。若预先包被抗原,则可用
8、于ASC测定,这时,每一个斑点代表一个分泌特异抗体的细胞。完成了以上步骤后其实只是完成了实验的一半。在你不断
