ELISPOT技术实验步骤.doc

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1、ELISPOT技术原理    在免疫学领域中，对于疾病以及疫苗研究不仅仅局限于体液免疫应答（B细胞免疫），细胞介导的免疫应答(cellmediatedimmuneresponse，CMI)也是人们所关注的，而T细胞在CMI中起关键作用。在研究免疫应答机制时以往常用用酶联免疫吸附法（ELISA）检测体液中游离的细胞因子（CK）或抗体，但由于游离的循环抗体或CK的半哀期不同，使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合，而不能确切的反映体内的抗体及CK的水平。80年代，国外的科研工作者根据ELISA技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术（EL

2、ISPOT）。作为一项新型的免疫酶技术——酶联免疫斑点法(enzymelinkedimmunospotassay，ELISPOT)，是从单细胞水平检测分泌抗体细胞(ASC)或分泌细胞因子(CK)细胞的一项细胞免疫学检测技术。由于该方法具有较高的特异性和敏感性，易操作，成本相对流式细胞分析术也较低，已被广泛用于分泌CK细胞检测或ASC测定中，对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。    ELISPOT法源自ELISA，又突破传统ELISA法，是定量ELISA技术的延伸和新的发展。两者都是检测细胞产生的细胞因子或其他可溶性蛋白，它们最大的不同在于：    （1）ELISA通过

3、显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。    （2）ELISPOT也是通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表1个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。（某些研究不仅要测细胞因子生成量，还需检测分泌此细胞因子的细胞频率）    由于是单细胞水平检测，ELISPOT比ELISA和有限稀释法等更灵敏，能从20万-30万细胞中检出1个分泌该蛋白的细胞。捕获抗体为高亲和力、高特异性、低内毒素单抗，在研究者以刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌

4、细胞因子。    下面将从发展、原理、具体实验操作、技术优势和应用几方面进行介绍。ELISPOT技术的发展（1）ELISPOT技术的过去    ELISPOT是20多年前便己研发成功的老技术。Czerkinsky等人率先在1983年，运用该技术成功地检测出因受激而分泌抗体的B细胞频率。从那时起世界各国免疫学者便开始一长期的ELISPOTCytokine技术竞赛，每个团队都希望能率先将此一技术推广来研究T细胞免疫，其绝妙之处在提供一接近体内实验的环境，藉由侦测T细胞分泌的各类细胞因子，来定量机体内免疫反应启始者PrecursorT的clonalsize族群大小，同时预测体内免疫系

5、统即将进行的下游免疫反应。　　ELISPOTCytokine技术虽说操作简单，但该技术并没能如预期地很快地被成功应用在exvivoT细胞功能研究。要让ELISPOT技术从B细胞免疫走向T细胞免疫的产生的第一个主要问题，便是灵敏度的提升，因为T细胞因子较之B细胞免疫球蛋白产量极少。早期ELISPOT的分析条件不是非常理想，成对抗体的品质、呈色底膜的材质等几个技术性的问题，使当时多数研究团队很难获得清晰的斑点，结果是敏感度不够、数据分析重现性低。这问题直到1996美国俄亥俄卅CaseWesternReserve大学PaulLehmann团队引进PVDF薄膜的应用（Forsthube

6、retal.,Science,1996），才釜底抽薪地解决了该技术因斑点呈色问题造成低敏感度的缺失。与原来的标准膜面相比，PVDF薄膜提供1,000倍的较大面积来吸附单株抗体，使T细胞分泌的各类细胞因子能在细胞周围就近被俘虏，让呈色斑点集中、清晰、对比色高，大大的提高ELISPOTCytokine分析的敏感度。图一是使用PVDF-BASED改良薄膜（PanelA）与传统标准薄膜（PanelB）并行实验的比较结果。同样的人体PBMC样品，在通过完全相同的实验，PanelA呈现较清晰的小色点。　　第二个技术性问题是ELISPOTCytokine实验分析的几个基本假设缺乏科学实证，也

7、使得该技术在当时并没受到该有的广泛重视。没有科研人员尝试去厘清一些基础但很重要的问题，诸如；　　  实验所得的斑点是抗原特定T细胞所生产，还是旁观细胞受Cytokine刺激的次级效应？  斑点的小或大有何生理意义；如何决定cutoff值？  能否相信斑点是由单一的细胞造成？  ELISPOTCytokine分析技术能准确测量的频率范围？  如果效应相互拮抗的cytokine同时产生，它们是否会互相妨碍？及到什么程度？（2）ELISPOT技术的现在　　1996年以来随着抗体制备、PVDF膜材篁