cloning and prokaryotic expression of serpin-2 gene of bombyx mori

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1、苏州大学本科生毕业设计（论文）目录摘要1前言31材料和方法41.1材料及主要试剂41.2方法41.2.1引物设计41.2.2PCR扩增目的片段41.2.3目的片段的分离和回收（Takara回收试剂盒）51.2.4酶切反应51.2.5连接反应61.2.6感受态细胞制备61.2.7连接产物的转化61.2.8试剂盒抽提质粒DNA61.2.9重组质粒的鉴定及测序61.2.10原核表达71.2.11SDS-PAGE蛋白电泳82结果92.1野桑蚕Serpin-2基因的cDNA序列克隆92.2野桑蚕Serpin-2基因的cDNA序列分析102.3Serp

2、in-2重组表达载体酶切鉴定142.4蛋白质表达与SDS-PAGE分析152.5WesternBloting分析153讨论16参考文献：17致谢18附录1.19附录2.20-18-苏州大学本科生毕业设计（论文）家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin-2的克隆、序列分析及表达摘要本研究以家蚕中大造品种为材料，以其cDNA为模板克隆家桑蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin-2基因；采用大肠杆菌原核表达系统（BL21）进行家蚕Serpin-2基因的表达研究。主要结果如下：根据已知野蚕Serpin-2（GenBank登录号：AF242200.1）序列设

3、计合适的引物，采用PCR方法克隆了家蚕Serpin-2基因。序列分析表明，家蚕Serpin-2基因编码区长度为990bp，编码329个氨基酸，相对分子量约为43.75kDa，等电点约为4.67。与家蚕Serpin-2比较发现，两者基因序列相似度高达99.29%，氨基酸序列相似度高达98.93%，推测家蚕Serpin-2与野桑蚕Serpin-2基因起着相同或类似的作用。将家蚕大造Serpin-2基因克隆进原核表达载体pET-28a(+)，转化到大肠杆菌BL21中，经1mmol/LIPTG诱导蛋白质表达。SDS-PAGE电泳分析结果表明，经IP

4、TG诱导转化家蚕Serpin-2的BL21菌与对照BL21菌、空pET-28a(+)转化BL21菌相比出现了一条特异性的蛋白质条带，相对分子量约44kDa，与预计的大小相符，证实家蚕Serpin-2在大肠杆菌中得到表达。家蚕Serpin-2基因的成功克隆和原核表达研究为从分子水平上解析Serpin在野桑蚕体内的功能打下了基础。关键词：家蚕；Serpin-2；基因克隆；原核表达-18-苏州大学本科生毕业设计（论文）CloningandprokaryoticexpressionofSerpin-2geneofBombyxmoriAbstract

5、Inthisstudy，thegeneofSerpininBombyxmori(Serpin-2)wasclonedbyPCRusingthewholebodycDNAsastemplates.E.coliprokaryoticexpressionsystemwasusedforexpressionstudyofserpin-2gene.Themainresultsareasfollows:AccordingtothesequenceofBombyxmandarinaserpin-2gene,properprimerwasdesigneda

6、ndSerpin-2geneofBombyxmori（TheGenBankaccessionnumbers：AF242200.1）wasclonedbyPCR.Accordingtosequenceanalysis,the990bpcodingregionofSerpin-2encoding329aminoacidresiduesresultsintheoreticalmolecularweightof43.75kDa,isoelectricpointof4.67.CompariedtotheSerpin-2geneofBombyxmori

7、andBombyxmandarina，thegeneidentityandaminoacididentityreach98.7%，respectively.ItrevealsthatSerpin-2ofBombyxmoriandBombyxmandarinamayplayasameorsimilarrole.TheSerpin-2genewasconstructedtotheprokaryoticexpressionvectorpET-28a（+）andthentransformedintoE.coliBL21(DE3).And1mmol/

8、LIPTGwasusedtoinducethetargetproteintoexpress.SDS-PAGEanalysisindicatedthattherewasaspeci