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1、白介素6对非酒精性脂肪性肝病的调节作用研究 0引言 非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholicfattyliverdisease,NAFLD),是一种以肝脏脂肪浸润、肝细胞炎症坏死为特征的慢性疾病,可以由单纯性脂肪肝进展至非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholicsteatohepatitis,NASH)、肝硬化,甚至肝细胞肝癌.NAFLD在西方发达国家发病率24%-42%,而在糖尿病患者中发病率可达70%-80%[1,2].2009年Fan等[3]报道上海脂肪肝发病率为17%.2012年我们研究[4,5]
2、发现,在上海工作人群中约38.1%的人患有脂肪肝,其中男性多于女性,随着年龄增加,患病率增加,在上海老年人群中患病率可以达到57.67%.NAFLD已逐渐成为影响人民健康的常见疾病. 目前NAFLD的发病机制仍未明确,细胞因子及胰岛素抵抗在发病中起了重要作用[6].白介素-6(interleukin-6,IL-6)第一个报道可以预测或者导致胰岛素抵抗细胞因子[7].一系列的研究发现在血浆和/或组织中的IL-6水平升高会导致胰岛素抵抗[8].在肥胖和2型糖尿病患者中,IL-6的水平是升高的[9].进行减肥手术(bari
3、atricsurgery)的患者血清中IL-6浓度降低,同时伴随患者的体质量减轻和胰岛素抵抗减轻.饮食诱导的肥胖小鼠使用IL-6抗体治疗后,胰岛素的敏感性明显增强,同时血脂可回归至正常水平.IL-6-/-基因敲除小鼠存在胰岛素抵抗,而且小鼠成年后表现为肥胖体型,血中胆固醇和甘油三酯水平较高[10].而IL-6+/+转基因小鼠则无胰岛素抵抗,血中胆固醇和甘油三酯水平较低[11].以上研究结果提示,IL-6在胰岛素抵抗和脂代谢中起重要作用. IL-6属于IL-6细胞因子家族,可由脂肪细胞、免疫细胞和内皮细胞分泌,可作为肝
4、脏细胞刺激因子,诱导各种急性期基因的表达.IL-6通过结合IL-6受体后诱导gp130形成同二聚体发挥作用,但对于细胞内gp130如何发挥作用的机制仍不确切[12,13].我们认为,IL-6参与了NAFLD的胰岛素抵抗及炎症反应过程,但其是如何通过信号通路来影响脂肪肝的发生和发展仍然不明确,故进行了本项研究.本研究首次尝试使用人肝脏L-02细胞进行脂肪肝实验[14,15],期望通过脂肪肝的细胞模型来进一步研究IL-6可能发挥作用的细胞因子信号通路,为治疗NAFLD提供新的靶点. NAFLD提供新的靶点. 1材料和方
5、法 1.1材料小牛血清、RPMI1640培养基(Gibco公司);亚油酸(sodiumoleate)、棕榈酸(sodiumpal-mitate)均购自Sigmaaldrich公司;TRIzol(Gibco公司);细胞总RNA提取试剂盒(上海生工生物技术服务有限公司);实时定量PCRSYBRgreenPCRmastermix试剂盒(TaKaRa公司);细胞蛋白裂解液(RIPA,上海申能博采);蛋白质含量检测试剂盒BCA(bicinchoninicacid,PIERCE公司);蛋白质转移用硝酸纤维膜(Bio-Rad公司)
6、;所有一抗均购自CellSignaling公司;所有二抗均购自SantaCruz公司;蛋白条带显色剂ECL(Amersham);ELISA试剂盒(妙通生物公司);蛋白芯片杂交标准流程和试剂盒(FullMoon公司).4℃离心机(预冷Fresco17,ThermoScientific,USA);常温离心机(Pico21,ThermoScientific,USA);酶标仪(PEVictor,PE,USA);涡旋振荡器(Vortex5,QILINBER,China);摇床(TS-2,Kylin-BellLabInstrume
7、nts,China);芯片小型离心机(ChipMatePMC-082,Tomy,Japan);芯片扫描仪(GenePix4000B,AxonInstruments,USA);软件GenePixPro6.0(AxonInxtruments,USA);RotorGeneQ定量PCR仪(Qiagen公司). 1.2方法 1.2.1细胞培养及脂肪肝模型构建:人肝细胞株L-02用含10%小牛血清的RPMI1640培养基培养(37℃、50mL/LCO2).将亚油酸和棕榈酸分别以3∶0、2∶1、1∶1、1∶2、0∶3作用于培养的
8、细胞,24h后,形成脂肪浸润的肝脏细胞模型.应用MTT方法进行脂肪酸的细胞毒性检测.使用1mg/L尼罗红进行荧光染色,在荧光显微镜下(激发光488nm,发射光550nm),运用图像分析系统选择最佳比例浓度的脂肪肝细胞模型. 1.2.2细胞因子给药:IL-1β、IL-6、IL-17α分别作用于细胞,MTT方法
