重组酱油曲霉碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白制备抗氧化肽的研究

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1、重组酱油曲霉碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白制备抗氧化肽的研究朱永丽亶松蓥殷爽刘_^何璐娜韶关学院英东生命科学学院利用重组酱油曲霉碱性蛋Q酶（rAp）对大豆分离蛋Q进行水解，制备Y抗氧化肽;进一步对抗氧化肽的抗氧化能力和苦味情况等方而进行了研允.结果表明:重组碱性蛋白酶对大豆分离蛋白具有较强的水解效果，当酶与底物比（E/S）为3OOOU/g时，大豆分离蛋白的水解度达到17.09%;当E/S为5000U/g时，抗氧化肽对DPPH自由基的清除率高达83.38%,对亚汕酸也具奋较强的抗氧化性，并且该抗氧化肽的苦味不明显.在同样条件下，rAp对大豆分离蛋

2、白的水解效率、抗氧化肽的活性和低苦味均优于商品化的碱性蛋G酶和木瓜蛋G酶.这些结果表明rAp具有较好的应用潸力，并且其抗氧化肽在化妆品、饲料和食品等行业中也具有较好的应用前景.关键词：重组酱油曲霉蛋Q酶;大豆分离蛋Q;抗氧化肽;.则样品的水解度为:DH(%)=100(1000X0.IX(V,-Vo)/5.OO/c-O.33)/7.8式中:c为样品中原大豆分离蛋白的浓度，g/L；O.33为大豆分离蛋白中游离氨基酸的浓度，mmol/g;7.8为每克大豆分离蛋G的肽键当量数，mmol/g.1.2.6抗氧化肽对DPPH自由基清除能力的测定利用DPP

3、H无水乙醇在517nm有紫色团的特征吸收峰，以分光光度计测定加入活性肽后，在517nm处吸收值的下降表示其对DPPH自由基的清除能力[8_9].在2mL离心管中加入1inL2XlOmol/L的DPPH无水乙醇溶液，再加入1inL抗氧化活性肽的无水乙醇，混匀，在室温下30min后，517nm处测得吸光值A,，同时测定1niL2X10mol/L的DPPH无水乙醇溶液与1mL无水乙醇混合液的吸光值A。，以及1mL抗氧化活性肽与2mL无水乙醇混合液的吸光值A』.DPPH自由基的清除率计算公式如下：1.2.7抗氧化肽的硫氰酸铁测定法向试管中加入1mL

4、抗氧化剂活性肽的无水乙醇溶液，然后加入1mL2.5%亚油酸无水乙醇熔液、2mL0.05mol/Lp11为7.0的磷酸缓冲液、1mL蒸馏水，密封.空白对照以无水乙醇代替抗氧化活性肽，4°C保存.从0时刻开始计，每24h检测一次.检测时，取出0.1mL亚油酸乳化液于空试管中，加入9mL无水乙醇、0.1mL30%硫氰酸氨溶液、0.1mL0.02mol/L溶于3.5%盐酸的氯化亚铁溶液，迅速混匀，反应3min后，于500nm处检测其吸光值.1.2.8抗氧化肽的苦味评价称取PTC配成的浓度1/750mol/L,编为1号液.并依次将1号溶液按倍比法稀释

5、.并编号为PM号液，分别装入消毒好的饮用杯中.将3种酶E/S为8000U/g制得的大豆多肽与不同浓度的PTC溶液进行感官苦味评定，从而确定大豆多肽的苦味值.苦味评定小组由实验室9位冇相关经验的志愿者组成.进行感官评定之前，要对评定小组成员进行苦味评定培训，使其适应苦味评定，品尝结果的平均值为该样品的最后苦味值.2结果与分析2.1重组酱油曲霉碱性蛋白酶的表达纯化结果对工程菌株诱导表达的重组蛋白酶的纯化结果如图1所示.由图1nJ•见，箭尖指向的蛋白条带为重组碱性蛋白酶，这是由丁•该蛋白酶基因推测的蛋白理论大小约为35.0kDa,电泳所得的蛋白条

6、带与理论推测一致.由图1进一步表明本试验获得了电泳纯的重组蛋白酶.阁1重组碱性蛋白酶的纯化电泳阁下载原阁2.2重组碱性蛋白酶对大豆分离蛋白的水解结果重组酱油曲霉碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶对大豆分离蛋白的水解结果如图2所示:在E/S为1000U/g、3000U/g、5000U/g、8000U/g的条件下，木瓜蛋白酶对大豆分离蛋白的水解度分别为1.64%、4.06%、6.21%、8.71%;重组酱油曲霉碱性蛋Q酶对大豆分离蛋Q的水解度分别为7.83%、17.09%、19.53%、19.43%;碱性蛋白酶对大豆分离蛋白的水解度分别为11.

7、88%、12.23%、12.78%、14.78%.木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶随着E/S的增加对大豆蛋白的水解度持续升高；而重组酱油曲霉碱性蛋白酶E/S达到5000U/g时对大豆分离蛋白的水解度趋于稳定.总体而言，在E/S相同的情况下，重组酱油曲霉碱性蛋白酶的对豆分离蛋白的水解效率和水解程度均明显高于商品化的木瓜蛋0酶和碱性蛋0酶.图2重组酱油曲霉蛋白酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶对大豆分离蛋白的水解效果2.3抗氧化肽的抗氧化性分析表3抗氧化肽对DPP11自由棊清除率结果2.3.1抗氧化肽对DPPH自由基清除率重组酱汕曲霉碱性蛋白酶与2种商品化蛋白酶

8、制备的抗氧化肽对DPPH自由的基清除率结果见表1.由表1可知，随着E/S的比例增加，制备的抗氧化肽对DPPH自由基的清除效果越强，当E/S为5000U/g时，重组酱油曲霉碱性蛋白