炎症因子诱导形成脂肪肝的分子机制

《炎症因子诱导形成脂肪肝的分子机制》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、炎症因子诱导形成脂肪肝的分子机制　　非酒精性脂肪肝(non-alcoholicfattyliverdisease，NAFLD)包括了肝脏损伤的一个广泛的疾病谱。从单纯性脂肪变性到非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholicsteatohepatitis，NASH)，随后可进展为肝硬化和终末期肝病。其中NASH作为NAFLD中的关键阶段，研究其发病机制对NAFLD的治疗起着相当重要的作用。　　　　现已有研究证实NAFLD中甘油三酯和游离脂肪酸的代谢失调机制，但胆固醇在炎症状态下参与第二次打击，形成NAFLD的机制仍不清楚。本实验利用四氯化碳(carbontetrachloride，CC

2、l4)的趋肝毒性使小鼠肝细胞发生内质X应激，使固醇调节元件结合蛋白(sterolregulatorybindingproteins，SＲEBPs)表达增加，导致肝细胞内脂质集聚，出现肝细胞的脂肪变性，实现第一次打击，再用酪蛋白诱发慢性低丰度炎症的产生，探讨炎症因子作为一个独立的危险因素在肝细胞脂肪变性的基础上发挥第二次打击形成脂肪肝的分子机制。　　　　1材料与方法　　　　1．1实验动物　　　　6～8周龄C57BL/6J雄性小鼠(购自重庆医科大学实验动物中心)12只，体质量20～26g，许可证号:SCXK2012-0001，重庆医科大学实验动物中心SPF室饲养。采用随机数字表法将小鼠分为

3、2组。对照组(n=6):隔天皮下注射质量分数40%的CCl4-植物油溶液(0．3mL/100g)2周后，再隔天皮下注射生理盐水0．5mL16周;炎症组(n=6):隔天皮下注射质量分数40%的CCl4-植物油溶液(0．3mL/100g)2周后，再隔天皮下注射10%酪蛋白(casein)0．5mL16周。实验结束后，留取小鼠血清和肝脏组织，－80℃保存。　　　　1．2血清中炎症因子测定　　　　淀粉样蛋白(serumamyloidA，SAA)和肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α，TNF-α)的浓度使用ELISA试剂盒检测(分别购自

4、美国Ｒ＆D公司及欣博盛生物科技有限公司)。　　　　1．3血清脂质含量测定　　　　小鼠血清中总胆固醇(totalcholesterol，TC)、低密度脂蛋白胆固醇(loin，蒸馏水冲洗多余染液，伊红染色2min，95%酒精脱水5min，二甲苯透明5min，中性树胶封片。冰冻切片用10%福尔马林盐溶液固定30min，1，2-丙二醇孵育2min后，油红O(Sigma公司)染色10～15min，苏木精复染1min，流水冲洗返蓝10min，甘油封片。再分别在显微镜下观察肝组织脂肪病变程度。　　　　1．5实时荧光定量　　　　PCＲ采用Trizol法提取肝组织总ＲNA，用DEPC水稀释后测定浓度及D

5、(260)/D(280)值(正常值为1．8～2．0)，标化到相同浓度。按照逆转录试剂盒(TaKaＲa)操作说明将总ＲNA逆转录成cDNA。采用SYBＲGreen荧光定量ＲT-PCＲ检测肝组织的低密度脂蛋白受体(loentbindingprotein2，SＲEBP-2)、SＲEBP裂解激活蛋白(SＲEBPcleavageactivatingprotein，SCAP)的mＲNACt值，引物序列见表1。取2μL逆转录产物进行实时荧光定量PCＲ，以β-actin作为内参照，反应体系为20μL。扩增条件:95℃30s预变性，95℃5s，58℃30s，70℃1min，共40个

6、循环。采用相对定量ΔΔCt计算2组小鼠基因表达的差异，计算公式如下:实验组相对于对照组基因表达水平的倍数=－exp(ΔΔCt)，其中ΔΔCt=实验组ΔCt－对照组ΔCt，ΔCt=目的基因Ct值－内参基因Ct值。　　　　1．6免疫组织　　　　化学染色肝组织固定后石蜡包埋切片，兔抗LDLr一抗(1∶200，北京博奥森)，兔抗SＲEBP-2一抗(1∶300，北京博奥森)，兔抗SCAP一抗(1∶250，北京博奥森)4℃孵育过夜，用即用型免疫组化试剂盒(北京中杉金桥)进行染色，具体步骤详见

7、说明书。DAB染色后，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜下观察照相，肝细胞中棕黄色颗粒分布为阳性表达。　　　　1．7GCＲ)调节胆固醇的内源性合成，而过多的胆固醇则通过三磷酸腺苷结合盒转运体A1、G1转到细胞之外。其中机体通过LDLr摄入血浆胆固醇是细胞内胆固醇的主要。本研究通过动物体内实验证明肝细胞经二次打击形成严重脂肪肝的胆固醇代谢失调机制。采用CCl4激发肝细胞膜脂质过氧化反应，引发内质X应激，内质X应激时，胆固醇被消耗，从而