livin反义寡核苷酸对肺腺癌a549细胞增殖的影响

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1、Livin反义寡核苷酸对肺腺癌A549细胞增殖的影响：宋萍郑金旭管淑红,邵启祥李坚【摘要】目的：探讨Livin基因反义寡核苷酸(antisenseoligodeoxynucleotides,ASODN)对肺腺癌A549细胞增殖的影响。方法：用阳离子脂质体介导LivinASODN转染至A549细胞，反转录聚合酶链反应(RTPCR)检测Livin基因mRNA的表达;MTT法检测转染细胞的生长抑制情况。结果：转染ASODN后A549细胞的Livin基因mRNA的表达明显减少，Livin基因ASODN显著抑制A549细胞增殖，并呈剂量依赖性，与对照的错义寡核苷酸(missenseoli

2、godeoxynucleotides,MSODN)比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论：Livin反义寡核苷酸能明显抑制A549细胞Livin基因mRNA的表达，抑制细胞增殖，Livin基因有望成为肺癌基因治疗的新靶点。【关键词】肺癌;反义寡核苷酸;Livin　　[Abstract]Objective:Toexploretheeffectsantisenseoligodeoxynucleotides(ASODN)ofLivinmRNAontheproliferationofhumanlungadenocarcinomaA549cells.Methods:LivinAS

3、ODNediatedbylipofectamine2000.TheexpressionsofLivinmRNARNAinASODNgroupanner.Thecellgroissenseoligodeoxynucleotides(MSODN)(P<0.05).Conclusion:LivinASODNsignificantlydoRNAandincreasedgroaybeeaneoleculartargetforgenetherapyforlungcancer.　　[Keyresco公司);LipofectamineTM2000，Trizol(Invitrogen公司);

4、ReverAid试剂盒(Mbi公司);ExTaq酶为TaKaRa公司产品;人肺癌细胞A549由江苏大学生命科学院提供。　　1.2方法　　1.2.1细胞培养A549细胞选用含10%小牛血清的DMEM培养液中，置于37℃，5%CO2的饱和湿度恒温细胞培养箱中培养。　　1.2.2寡核苷酸的设计与合成ASODN及错义寡核苷酸(missenseoligodeoxynucleotides,MSODN)序列参照文献[1]，由上海生工生物工程有限公司合成，并对寡核苷酸进行硫代磷酸化修饰，以提高其血清稳定性。反义序列为5′ACCATCACCGGCTGCCCAGT3′;错义序列为5′GTCAG

5、GATCTTCCCACGGAG3′。　　1.2.3细胞转染及分组当细胞进入对数生长期后，0.25%胰酶消化接种,待细胞贴壁融合达70%，换成无血清培养基。按照LipofectamineTM2000试剂说明书将脂质体分别与ASODN和MSODN在无血清培养基中混合，制成脂质体寡核苷酸复合物(LipASODN和LipMSODN)。根据处理A549细胞的方式不同分为6组：加入LipASODN终浓度为200nmol/L的A200组，终浓度为400nmol/L的A400组，终浓度为600nmol/L的A600组;加入LipMSODN终浓度为200nmol/L的M200组;只加入

6、脂质体的Lip对照组;同时设未加任何处理的空白对照组。细胞转染6h后更换含血清培养基，继续培养48h。　　1.2.4RTPCR检测LivinmRNA表达于转染后48h收集各组细胞，用Trizol提取总RNA，经紫外分光光度仪检测总RNA浓度后，用ReverAid试剂盒获得cDNA。参考Livin基因序列设计引物，上游引物序列:5′CTGAGGAGTTGCGTCTGGC3′,下游引物序列：5′GCACGGCACAAAGACGAT3′,扩增片段长度为545bp。另设计看家基因GAPDH作为内参照，上游引物序列为：5′GGATTTGGTCGTATTGGG3′，下游引物序列

7、为：5′GGAAGATGGTGATGGGATT3′，扩增片段长度为205bp。所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。PCR扩增条件：94℃变性5min，95℃30s,55℃退火30s,延伸72℃30s，36个循环。PCR产物经2%琼脂糖电泳鉴定。目的基因LivinmRNA的相对表达量以Livin/GAPDH灰度比值表示。　　1.2.5MTT法检测A549细胞转染后的生长抑制率当细胞进入对数生长期后，0.25%胰酶消化，用培养基调整其浓度为1×105/ml,每次取100μl