定向基因传递载体pet15bzvp1的构建

《定向基因传递载体pet15bzvp1的构建》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、定向基因传递载体pET15bZVP1的构建【摘要】目的在JCVVP1氨基末端插入SPA的IgG结合区(Z区)，构建原核表达质粒pET15bZVP1。方法PCR扩增JCV基因组VP1和SPA基因的Z片段;重组PCR连接Z片段和VP1;BamHⅠ和NcoⅠ双酶切将ZVP1片段插入原核表达质粒pET15b。结果经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳纯化，分别得到VP1和Z片段;再用重组PCR将Z片段和VP1连接成ZVP1重组基因;双酶切将ZVP1插入pET15b的BamHⅠ和NcoⅠ两个酶切位点之间，并经酶切鉴定和DNA测序证实。etho

2、dsTheVP1andZfragmentplifiedbyPCRfromplasmidpET15bandpEZZ18respectively,andthentheyentidpET15bbyrestrictionenzymeBamHⅠandNcoⅠ.ResultsTheVP1andZfragmentent,VP1andZfragment,idpET15bbetHⅠandNcoⅠsites,andconfirmedbyenzymedigestionandDNAsequencing.TheexpressionofVP1ZedbyidpET

3、15bZVP1hasbeenconstructedsuccessfullybyinsertingZfragmentintoaminoterminalofVP1.　　KEYaciaBiotech公司，包含两个重复的Z片段，每个Z片段全长174bp。质粒pET15b购自Novagen公司，为含T7启动子的表达质粒，氨苄青霉素抗性，全长5708bp。　　1.2方法　　1.2.1扩增VP1片段上游引物VP15′GCTCAGGCGCCGAAAATGGCCCCAACAAAAAG;下游引物VP13′GACAGGATCCTTACAGCATTT

4、TTGTCTGCAAC。下游引物中引入BamHⅠ酶切位点，加下划线表示，扩增基因片段长1065bp。　　用2μL质粒pET15bVP1为模板，PCR试剂盒进行扩增。PCR反应条件为：预变性95℃2min30s，变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃1min20s，共20个循环;72℃延伸5min，终止反应。PCR产物用20g/L琼脂糖凝胶电泳，确定目的条带，按照TIANGEN公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书操作，回收目的DNA(VP1片段)。　　1.2.2扩增Z片段上游引物Z5′CTGCGCAACACGATGCCATGG

5、TAGACAACAAA，下游引物Z3′CTTTTTGTTGGGGCCATTTTCGGCGCCTGAGC。上游引物中引入NcoⅠ酶切位点，加下划线表示，扩增基因片段长174bp。　　用2μL质粒pEZZ18为模板，PCR试剂盒进行扩增。PCR反应条件为：预变性95℃2min30s，变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃30s，共20个循环;72℃延伸5min，终止反应。PCR产物用20g/L琼脂糖凝胶电泳，确定目的条带，按照TIANGEN公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书操作，回收目的DNA(Z片段)。　　1.2.3双重PCR

6、连接Z片段和VP1片段以胶回收的2μLZ片段和2μLVP1片段为模板，分别以Z5′和VP13′为上、下游引物，建立PCR反应体系。PCR反应条件为：预变性95℃2min30s;变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃1min20s，共20个循环;72℃延伸5min，终止反应。PCR产物用20g/L琼脂糖凝胶电泳，确定目的条带，按照TIANGEN公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书，回收目的DNA(ZVP1片段)。　　1.2.4将ZVP1插入pET15b连接的ZVP1片段和质粒pET15b分别用BamHⅠ和NcoⅠ进行双酶

7、切，酶切产物用20g/L琼脂糖凝胶电泳，胶回收目的DNA。胶回收的ZVP1片段和质粒pET15b应用T4DNA连接酶连接，4℃过夜，胶纯化连接产物。　　1.2.5连接产物的鉴定重组质粒pET15bZVP1以BamHⅠ和NcoⅠ双酶切，20g/L琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察，进行双酶切鉴定;BamHⅠ和NcoⅠ双酶切鉴定筛选出的阳性克隆质粒交给生物公司，使用T7和T7ter测序。　　1.2.6VP1Z的表达和纯化应用热激发将重组质粒pET15bZVP1转化进入感受态细胞BL21(DE3)/plys，次日挑取单菌落接种于含

8、氨苄青霉素的LB培养基上37℃过夜培养。以1∶100的比例转接菌液，37℃继续培养3h，加入终浓度1mmol/L的IPTG，30℃继续振荡培养4h，以诱导VP1Z的表达。离心集菌后，以结合缓冲液重新悬浮，