_型鸭肝炎病毒VP1基因串联表达载体的构建.pdf

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1、《黑龙江畜牧兽医》科技版2011年8月(上)15Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因串联表达载体的构建李日顺，于淼，黄昌力，曹宗喜，王文华，张超佚，张桂红(华南农业大学兽医学院，广州510642)中图分类号:S852．65文献标识码:A文章编号:1004－7034(2011)08－0015－03关键词:Ⅰ型鸭肝炎病毒;2VP1基因;串联表达摘要:为了构建Ⅰ型鸭肝炎病毒双拷贝VP1基因的原核表达质粒，试验采用RT－PCR技术扩增鸭肝炎病毒VP1基因，将其连接到克隆载体pGEM－TEasy中得到重组克隆质粒pGEM－T－VP1，阳性克隆质粒经鉴定正确后，分别用BamHⅠ、XholⅠ、BglⅡ

2、进行酶切，重组后得到pGEM－T－2VP1，然后将双拷贝VP1基因亚克隆入原核表达载体pET－30a(+)中，得到重组质粒pET－30a(+)－2VP1。结果表明:得到了含有目的基因的阳性克隆。说明Ⅰ型鸭肝炎病毒双拷贝VP1基因原核表达质粒构建成功。ConstructionoftandemexpressionvectorVP1geneforDuckhepatitisvirus(DHV)type1LIRi－shun，YUMiao，HUANGChang－li，CAOZong－xi，WANGWen－hua，ZHANGChao－yi，ZHANGGui－hong(CollegeofVe

3、terinaryMedicine，SouthChinaAgriculturalUniversity，Guangzhou510642，China)Keywords:Duckhepatitisvirus(DHV)serotype1(DHV－1);2VP1gene;tandemexpressionAbstract:ToconstructarecombinantexpressingplasmidincludingtwoVP1genes(2VP1)ofDHV，accordingtocompletegenomeofDuckhepatitisvirus1(DHV－1)，twospecial

4、primerpairweredesignedtoamplifyVP1genes(2VP1)ofDHV．ThegeneofVP1wasclonedintothevectorT，thenitwassubclonedintotheprokaryoticexpressionvectorpET－30a(+)afterthesequencewasidentifiedbyBamHⅠ，XhoⅡ，BgⅢdigestionandsequencinganalysis．Theresultsshowedthattheligationdirectionoftheobjectivegenefragment

5、wascorrect．ItindicatesthattheprokaryoticexpressionvectorpET－30a－2VP1hasbeenconstructedsuccessfully．鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒(Duckhepatitis3D基因。Ⅰ型鸭肝炎病毒结构蛋白VP1位于virus，DHV)引起的雏鸭的一种高度致死、传播迅速DHV－Ⅰ基因组的2103～2816位，VP1全基因由的病毒性疾病。该病可由3种不同的病原引起，分别714个核苷酸组成，编码238个氨基酸。VP1作为是DHV－Ⅰ、DHV－Ⅱ和DHV－Ⅲ鸭肝炎病毒，相互DHV－Ⅰ的主要结构蛋白大部分暴

6、露在病毒表面，是之间没有血清学关系，其中DHV－Ⅰ型呈世界性分决定病毒抗原性的主要成分，它能诱导动物产生中和布。最早于1945年在美国发现病毒性肝炎。1950抗体，也是抗原性的高变区。笔者以Ⅰ型鸭肝炎病毒［1］VP1基因为对象将其首尾串联，串联后的基因年，LevinePP等首次用鸡胚分离到病原，即DHV－Ⅰ。DHV－Ⅰ为小RNA病毒科成员，其核酸是(2VP1)定向亚克隆到原核表达载体pET－30a(+)由约7690nt碱基组成的单股正链mRNA，只含1个中成功构建了串联表达载体，这为Ⅰ型鸭肝炎病毒免较大的可读框(open－readingframe，ORF)，由5'非编疫原性研

7、究的应用奠定了基础。码区(untranslatedregion，UTR)、可读框、3'UTR和po-1材料与方法ly(A)尾组成。DHV结构蛋白编码区(P1区)编码病1．1毒株、菌株与载体毒特异性结构蛋白VP0、VP3和VP1;P2区和P3区Ⅰ型鸭肝炎病毒SS株、E．coliDH5α、pET－30a编码病毒的功能性(参与病毒复制)非结构蛋白，P2(+)表达载体，由华南农业大学禽病实验室保存;区包含2A、2B和2C基因，P3区包含3A、3B、3C和pGEM－TEasy载体，购自Promega公司。1．2工