改良混合酶消化法培养大鼠主动脉平滑肌细胞

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1、改良混合酶消化法培养大鼠主动脉平滑肌细胞：李成武，李应续，朱从丽，宋健【摘要】目的探讨改良酶消化法培养大鼠主动脉平滑肌细胞（VSMC）的方法，为动脉粥样硬化等血管硬化性疾病的发病机制和防治研究提供帮助。方法提取大鼠的胸主动脉，采用混合酶消化后，采用含10%FCSRPMI1640培养基培养。通过细胞计数观察细胞增殖，倒置相差显微镜观察血管平滑肌细胞的生物学性状，免疫组织化学进行细胞鉴定。结果消化肌平滑肌细胞24h后贴壁，平均贴壁率为76%，第5d后细胞数迅速增加，至第11d形成单层时，光镜下出现“峰谷”样生长；传代后，细胞的生长特性无改变，αS

2、MA免疫组化染色检测，证实细胞是VSMC。结论改良后酶消化法能短时、高效地培养生物学特征稳定的VSMC。【关键词】酶消化法;平滑肌细胞;胸主动脉;SD大鼠ABSTRACT:ObjectiveToexplorethecultivationofratvascularsmoothmusclecells(VSMC)byenzymaticdispersionentofangioscleroticdiseases.MethodsThethoracicarterymediatelyremovedandcutintofinetissuepieces,thenix

3、edmedium.Afterdigestion,thecellsoothmusclecellsicroscope,andimmunohistochemicalmethodbermonolayeron11thday.A"thepeakvalley"typeofgroicroscope.Afterpassages,thegroationcellmunohistochemicaltesting.ConclusionTheimprovedenzymaticdispersionmethodforVSMCcanincreasethecellstabilit

4、yofbiologicalcharacteristicse.KEY0002Boster）;胎牛血清（16000044，Gibco）；FITC标记的羊抗鼠IgG免疫荧光二抗。1.2主要溶液①DHank's液（g／L）：KCl0.4g，KH2PO40.06g，NaCl8g，NaHCO30.35g，Na2HPO40.0318g；②RPMI1640培养基（含10%FCS）：培养粉1.04g，双抗2ml，谷氨酰胺4ml，FCS10ml，加双蒸水至100ml；③0.4%胶原酶；④0.1%弹性蛋白酶；⑤0.1%脱氧核糖核酸酶Ⅰ型。1.3原代培养①取雌性SD大

5、鼠（体质量约180±20g）断髓处死，活力碘进行皮毛消毒，无菌条件下快速分离胸主动脉，并置于DHank's平衡盐液中；②冰上操作：DHank's洗涤3次，清除血管表面的脂肪和结缔组织；眼科剪纵向剪开血管，用无菌棉签擦血管内膜2～3次；钟表镊剥离血管中膜内2/3的平滑肌组织，并收集于不含血清的RPMI1640培养基中；③弃去组织块中的培养基，加入3倍组织块体积的新鲜配制的酶混合液（含0.4％胶原酶、0.1%弹性蛋白酶和0.1%、0.1%脱氧核糖核酸酶Ⅰ型），37℃恒温水平摇床中震荡54rpm，消化30min后，每隔10min用吸管轻柔快速吹打一

6、次，镜下观察组织消化，消化约1.5h后，镜下观察约90％以上组织成细胞悬液。用含10%FCS的RPMI1640培养基终止消化；④将酶混合物收集于离心管中，1000rpm×5min离心，弃去上清液；⑤细胞接种于含10%FCS，100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素的无酚红RPMI1640培养基中，调整密度约5×105/ml，在37℃，5%CO2环境下培养。①倒置相差显微镜下观察平滑肌细胞的形态和生长特性。②免疫组织化学鉴定：传一代时，取接种有细胞的无菌盖玻片，4%多聚甲醛室温下固定30min，PBS冲洗2～3遍后，置于30%H2O2纯乙

7、醇（30%H2O2∶纯乙醇=1∶50）溶液中室温下浸泡30min。蒸馏水冲洗3次，PBS冲洗1次后，加α平滑肌肌动蛋白（αSMA1∶250）在37℃孵育2h；PBS冲洗，加FITC标记的羊抗鼠IgG免疫荧光二抗（1∶500）37℃避光孵育1h后，PBS冲洗，显微镜下，任取6个视野计数，计数抗αSMA染色阳性细胞数（VSMC胞胞浆中出现细丝状棕褐色免疫反应产物为阳性）和总细胞数，计数阳性百分率的平均值为培养SVMC的纯度。2结果2.1原代培养VSMC形态学观察消化下来的细胞呈圆形或椭圆，培养24h后，细胞贴壁良好，76%的贴壁形态呈树枝状，4

8、8h后细胞开始伸展，呈梭形，但数量几乎没有改变。第5d后，进入对数增殖，大量细胞完全伸展，开始发生融合（图1），形成典型的长梭状。第11