深黄被孢霉δ6脂肪酸脱氢酶基因的原核表达和转基因植株再生研究

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1、深黄被孢霉Δ6脂肪酸脱氢酶基因的原核表达和转基因植株再生研究作者：王广科,李明春,李晋川,刑来君【摘要】目的通过农杆菌介导法将来源于深黄被孢霉的Δ6脂肪酸脱氢酶(D6D)基因导入到东北大豆绥农10和吉林47中，最终获得转基因植株。方法利用子叶节外植体诱导出丛生芽和再生植株，利用卡那霉素的抗性筛选培养基连续筛选以及PCR方法、DNA分子杂交分析和GC分析检测转基因植株中的Δ6脂肪酸脱氢酶基因表达状况。结果经过含50mg/L卡那霉素的抗性筛选培养基连续筛选，获得了一批转基因植株。经PCR检测和DNA分子杂交分析，初步证明Δ6脂肪酸脱氢酶

2、基因已导入并整合到大豆基因组中。将转基因大豆T1代和T2代种子进行脂肪酸GC分析，结果在大豆种子中检测到Δ6脂肪酸脱氢酶基因的产物GLA，证明该基因在大豆中得到了表达。【关键词】Δ6脂肪酸脱氢酶基因；大豆；农杆菌介导转化；脂肪酸GC分析；转基因植株【Abstract】ObjectiveTheΔ6fattyaciddesaturasegenesfromMortitierallaisabellinainfectionmethod,sometransgenicsoybeancotylendonnodes,Kanamycinresistant

3、culturemedium,PCRSouthernblotandGCanalysisdetectedconditionoftheΔ6fattyaciddesaturasegenesoftransgenicplants.ResultKanamycinresistant(Kmr)transgenicplantstransgenicplantsprovedthattheΔ6fattyaciddesaturasegeneses.Totalfattyacidsextractedfromthepositivetransgenicsoybeanato

4、graphy(GC)ofmethylesterstoconfirmthetransgenicsoybeancontainingafunctionalΔ6fattyaciddesaturasegene.ThepresenceofGLAindicatedthattheΔ6fattyaciddesaturasegenesfromMortitierallaisabellinaaxL.);Agrobacteriummediatedtransformation;GCanalysisoffattyacid;transgenicplantGLA是多烯

5、不饱和脂肪酸1（PolyunsaturatedFattyAcid，PuFA）n6代谢路线中的一种重要的脂肪酸［1］，它作为人体必需脂肪酸（Essentialfattyacid，EFAs），对人体具有双重功能，既是人体的必需营养元素，又是治疗疾病的重要药物。它在人体中可以转化为二高γ亚麻酸（DGLA）和花生四烯酸（AA），二者是合成前列腺素类物质的前体,对人体的激素调节及脂肪酸代谢发挥着重要的生理作用［2］。所以由GLA开始的一系列相关不饱和脂肪酸的研究将会在医药学、营养学、生物学等方面展开一个新的、更广阔的研究领域［3］。从亚油酸到γ

6、亚麻酸是由Δ6脱氢酶催化的，Δ6脱氢酶是以亚油酸为底物，在C6位上脱氢形成GLA.然后，通过碳链延长和脱氢作用，进一步形成花生四烯酸、前列腺素和白三烯类等生理活性物质。由于Δ6脱氢这一步是GLA形成的限速步骤，而且是由D6D催化的，因而D6D是GLA合成的关键因素［4,5］。近年来，先后报道了从高山被孢霉中分离出Δ6脂肪酸脱氢酶，并分别在酵母、米曲霉和烟草中获得功能性表达。大豆是主要的油料作物之一，富含亚油酸，而不含γ亚麻酸或含量极低。本实验室从1989年开始研究微生物发酵生产γ亚麻酸。近年来，对产γ亚麻酸的关键酶——△6脂

7、肪酸脱氢酶进行了克隆和序列分析，从高产γ亚麻酸的深黄被孢霉菌株中克隆出△6脂肪酸脱氢酶的结构基因，是世界上第十个克隆出该基因的实验室，在GenBank中的序列接收号为AF307934，并在酵母和烟草中得到表达［69］，这为将该基因转化到大豆中提供了前提和基础。本实验采用农杆菌介导的转化方法，将该基因转化到东北大豆品种绥农10和吉林47两个品种中，得到了一批转基因植株。1材料与方法1．1植物材料绥农10和吉林47等两个优良品种，由吉林省农科院大豆研究所提供。1．2菌株与质粒AgrobacteriumtumefaciensLBA4404，

8、由中科院微生物所方荣祥先生馈赠。pGA643（Kanr），由内蒙古大学哈斯阿古拉教授惠赠。pTMICL6（Ampr）（全长MID6DcDNA），南开大学真菌实验室保存。1．3主要