微透析技术在脑组织研究中的应用

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1、微透析技术在脑组织研究中的应用作者：陈银生，庄明华，姜苏明微透析技术是将推挽灌流和透析技术结合起来并逐渐完善的一种新型生物采样技术,可在麻醉或清醒的生物体上使用,特别适合于深部组织和重要器官的活体生化研究。微透析技术最早应用于脑内是在1972年美国耶鲁大学报道的猴脑的微透析研究，之后微透析即开始应用于对脑内神经递质的改变，药物动力学监测以及一些疾病脑内神经生理改变的研究，至今已有30多年的历史。本文就微透析技术在脑组织研究中的应用作一综述。　　1微透析技术的原理及探针回收率的测定微透析技术是以透析原理作

2、为基础的在体取样技术，是在非平衡条件下即流出的透析液中待测化合物的浓度低于它在探针膜周围样品基质中的浓度，灌注埋在组织中的微透析探针，组织中的待测化合物沿浓度梯度扩散进入透析液，被连续不断地带出，从而达到从活体组织中取样的目的，通过测定流出液即透析液中待测物的浓度来研究组织中待测物的水平。这是一种动态连续的取样方法。简单地说，微透析技术的原理就相当于在组织中创造了一个“毛细血管”，使化合物在浓度差的作用下扩散而进入此“毛细血管”，然后随液体流动带出体外进行检测。微透析技术最大的优点是可在基本上不干扰体内

3、正常生理过程的情况下进行在体、实时和在线取样,透析过程探针周围的组织液成分不会发生改变，所以可以持续收集样品，而且被透析动物可以小到老鼠一般大小。通过微透析技术可以单独取得细胞外液,因此可对大脑神经递质进行活体监测［1］，由于透析液中不含蛋白质和酶等生物大分子，能直接进样进行高效液相和毛细管电泳等生化分析，免除了复杂的进样前样品处理及由此而产生的样品损失和误差，也不会因在室温取样而酶解，提高了样品的稳定性，而且随着现代技术的进步可以对微透析试验进行全程的自动化控制。微透析试验中一个重要的步骤是要测定微透

4、析探针的回收率(透析液中待测化合物的浓度与其在样品基质中浓度之比)，由于微透析是在非平衡条件下取样，所以所测得的透析液中化合物的浓度只是探针周围样品基质中该化合物浓度的一部分。在了解该化合物待测部位的实际浓度时必须测定探针的回收率，它是影响微透析结果的重要因素，并取决于取样部位的生物学性质、透析膜的物理性质(材料，孔径，长度，几何形状等)、待测物质的分子量、灌流速度、压力、生物体本身的健康条件和生物节律等［2］。探针回收率有体内、体外之分，体外的测定方法比较简单，配制被测物质的标准溶液进行透析，测定透析

5、液中该物质的浓度，再与标准溶液浓度进行比较即可得出。体内的测定则较复杂，常用的体内测定方法①零净通量法，该法是将灌流液流速控制恒定,分别测定不同浓度的灌流液达到稳态后透析液中分析物的浓度。当灌流液中分析物的浓度低于探针外介质时，扩散方向就是从介质到探针；反之，即是从探针到介质。零通量点时，探针内外浓度相等。绘制灌流液不同浓度与透析液中分析物浓度的直线回归图，这时斜率即为探针回收率［3，5］。此法是一种带有尝试性的方法，需要对分析物在体内的浓度范围有一定的了解。②反透析法是用一种内标物加入到灌流液中进行透

6、析，通过测定透析液中内标物的浓度，与灌流液浓度做对比，用1减去该比值即为该物质的体内回收率［4，5］。这种内标物要求具有惰性，不与体内物质反应且又尽可能与待测物结构性质相近。该法优点在于可真实反映体内回收率的变化情况。③低速灌流法［2，3］，在灌流速度约为50nL/min时进行灌流，一般相对回收率可达90%。这种方法的缺点是显而易见的，不但在样本采集时耗时，且在灌流过程中样品挥发程度也很严重。在只需要知道被测物质的相对浓度变化时，可简单的测定探针的体外回收率，测定应在透析前进行，配制被测物质的标准溶液(

7、浓度要与该物质在体内的浓度相似)，用与体内试验相同的灌流速度灌流探针，达到稳定状态后收集透析液并进行检测，测定浓度与标准液浓度之比就是探针的体外回收率。此法虽简单易行，但由于被测物质在体内、外的状况不同，检测结果不能严格的等同于体内回收率。　　2微透析系统的组成及脑内微透析的操作步骤　　目前国际上生产微透析系统的公司主要有：瑞典CMA公司，美国BAS公司，以及日本的Ei公司，我们使用的是美国BAS公司的产品。中国科学院北京化学研究所［6］，中国科学院上海生物研究所，天津神经外科研究所都较早地开展了微透析

8、技术，而且可以自行设计微透析探针并申请了国家专利［7］。微透析系统主要有：微量灌注泵，与微量灌注泵相配套的微量注射器，连接管，微透析探针，与探针相配套的微透析套管以及微透析分段收集仪。另外在透析清醒大鼠时还需要一套光感应收集笼以保证大鼠在透析过程中可以自由活动而不影响透析过程。其中最关键的部分是微透析探针，它是由导入管,导出管,中空纤维管,半透膜组成。BAS公司有3种不同设计风格的探针(针式、直线型、分流型)。该公司提供的可选择探针有脑探针