hla新等位基因a-3018的序列分析和确认

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1、HLA新等位基因A*3018的序列分析和确认：李桢，邹红岩，邵超鹏，孙革，金士正，程良红【摘要】为了识别和确认中国汉族人群中的HLA新等位基因，使用PCRSSP、FLOI1640培养液为Sigma公司产品。A*3018序列特异性引物合成及PCR所需试剂由大连宝生物公司提供。主要仪器9700PCR扩增仪（PE公司产品），电泳仪（美国Embi公司产品），流式磁珠分析仪（Luminex100液相分析平台），3100测序仪（AppliedBiosystems公司产品），CO2培养箱（德国HeraeusBBD6220型）。HLA

2、分型及序列分析使用5%EDTA抗凝外周全血，取300μl用DNA快速提取试剂盒提取DNA。HLA低分辨率分型采用了PCRSSP以及FLOgCl2终浓度1.5mmol/L，dNTP终浓度0.4mmol/L，引物终浓度0.25μmol/L，TaqDNA聚合酶1.0U，DNA80ng。扩增条件为94℃预变性1分钟，94℃变性30秒、58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环，最后1循环72℃延伸5分钟后冷却至4℃。取扩增后标本10μl，置于20g/L琼脂糖凝胶中电泳。细胞株的建立采集外周血，用PBS对半稀释，按血与淋巴

3、细胞分离液（上海恒信试剂厂）=2∶1比例，小心地将血液加至分离液上层，400×g，离心20分钟；取白膜层，加8mlPBS洗涤，250×g，离心5分钟，弃上清；用无血清RPMI1640培养液洗涤，计数，然后250×g离心5分钟弃上清。按2×106个细胞/1mlEBV液将细胞混匀，37℃、5%CO2放置2-3小时，然后250×g离心10分钟去病毒。按1×106个细胞/毫升加入含20%FBS、2μg/mlCsA的RPMI1640培养液，于24孔板中，在37℃、5%CO2条件下培养，7天后换半液，以后3天换液1次，多个增殖灶形成

4、后换瓶培养，将CsA减半，细胞呈对数增长后去除CsA。AtriaGeicsAlleleSEQRHLABSBTPack试剂盒测序显示，HLAA*240201，300101的杂合结果在外显子2有3个碱基位置（碱基121、123、126）与数据库（IMGT/HLArelease2.13,April2006）不相符，杂合测序结果图见图2。使用ProtransS4HLAAsingleallelespecificsequencingset分别扩增A*24及A*30基因后，分别对其外显子2、3、4进行了双向测序，发现等位基因A

5、*240201没有碱基变异。该未知基因与其最相近的HLAA*300101相比，在exon2有3个碱基不同，碱基121A→C、123T→C导致密码子17AGT→CGC,17S（丝氨酸）→R（精氨酸）；碱基126A→G导致密码子18GGA→GGG，18G（甘氨酸）→G（甘氨酸），该氨基酸是同义突变。3个突变点与杂合测序结果所测位置相符。突变碱基及所致氨基酸改变见图3。Figure2.ResultsofheterozygoussequencingofHLAA*240201，300101(threenucleotidecha

6、ngesinexon2：121、123、126)该新等位基因序列已被GenBank接受，编号为DQ872509。根据世界卫生组织（GT/HLArelease2.13,April2006），故只检测出A*24，未检出A*30基因。FLOalikA,ParhamP,etal.IMGT/HLAdatabase—asequencedatabaseforthehumanmajorhistopatibilityplex.TissueAntigens,2000;55:280-2872曹孟德，秦东春，孙含笑.HLA分子生物学与临床应用.

7、河南：河南医科大学出版社,1998：16-173exico,determinedbysequencebasedtyping.TissueAntigen,2005;66:666-67313奚永志.我国骨髓库/脐血库HLA分型应注意的几个问题.中华医学杂志，2003;83:443-445