互补式亲和层析纯化制备兔源性抗人精子多克隆抗体标准品

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1、互补式亲和层析纯化制备兔源性抗人精子多克隆抗体标准品：夏玲芝　沈传来　唐秋莎　谢维　张建琼【摘要】目的：纯化制备兔源性抗人精子多克隆抗体标准品。方法：利用人精子抗原及其他组织蛋白等分别制备亲和层析柱，经正反相互补式亲和层析从兔抗血清中纯化IgG和IgA型抗人精子多克隆抗体，用SDSPAGE、ethodsThreetypeofaffinitychromatographycolumnrespectivelymadefromhumanspermantigen,normalserumandlysateofnormaltissuecellspolyclon

2、alantibody(IgGandIgA)fromrabbitantihumanspermserum.Theresultingantibodyelinkedimmunoabsorbentassay(ELISA)fordeterminingitspurity,specificityandlinearreactionantigen.ResultsThepurifiedantispermantibodyshoanserum,lysateofhumannormaltissuecellsmunodiagnosticreagents.Attheconcen

3、trationrangeof0.4882–7.8120ng·ml－１(forIgGisotype)or1.953–31.250ng·ml－１(forIgAisotype),thepurifiedantibodyreactedinELISAantigeninalinearmanner.ConclusionThepurificationscheduleisfeasibleforpreparationofantibodystandardusedinantibodyquantitativedetection.　Keyantibody；quantitativ

4、eenzymelabeledimmunosorbentassay；affinitychromatography　　我国不孕育症发生率占已婚夫妇的8%～15%，近20%为免疫性不孕育，其中抗精子抗体的重要致病作用已被大量实验和临床观察所证实［15］。存在于男女血清、精浆及宫颈分泌液中的抗精子抗体的浓度高低直接决定着其抗生育效应的强弱，也是疗效观察和预后判断的有效量化指标。因此，抗精子抗体的定量检测对诊断和治疗免疫性不孕育非常重要。然而，由于精子抗原种类繁多，抗精子抗体标准品不易获得，目前我国尚无厂家生产抗精子抗体定量检测试剂盒。大多数医院采用酶标

5、法或金标法试剂盒进行抗精子抗体的定性检测，极少数医院采用昂贵的进口试剂盒进行定量分析［611］。但是这些进口定量试剂盒实际上仍属于半定量的性质，他们都只能以U·ml－1来表示所测抗精子抗体的浓度，而并不能准确说明一个U代表多少质量（ng或pg）的抗精子抗体，而且每家公司各自定义其标准品中抗精子抗体的单位数，互不可比。本研究首次利用高纯度人精子膜抗原等多种蛋白制剂制备互补式亲和层析柱，从经人精子免疫的兔血清中提取纯化出纯度高、与正常人血清蛋白和组织细胞裂解液无交叉反应的高特异性抗人精子多克隆抗体标准品，为进一步纯化人源性抗人精子多克隆抗体标准品奠定

6、了基础，有利于我国抗精子抗体定量检测方法的建立。有关纯化方案已申请国家发明专利。　1材料与方法　1.1免疫接种及人精子膜抗原的提取纯化　取精液常规检查为正常的人精液标本（从南京金陵男科医院收集）200ml，经0.01mol·L-1pH7.4PBS离心（1200r·min-1）洗涤3次，用生理盐水制成精子悬液后常规免疫家兔3次，皮下多点注射，每次1×106，每次接种间隔2周。末次免疫后2周心脏取血，分离兔血清，分装后置-70℃冰箱保存备用。　人精子膜抗原采用超声波粉碎、NP40萃取与3种互补式亲和层析柱(A、B、C柱)相结合的新提纯方案而得，经与两

7、种市售ELISA试剂盒比较，阴阳性符合率达100%，且与正常人血清标本无反应，OD值≤0.08［12］。　1.2主要试剂　Br活化的SepharoseCL4B、HRP、TMB、DAB（Sigma公司），DEAE52纤维素、SephadexG200（illipore公司），HRP标记的羊抗兔IgG和羊抗兔IgA（北京天坛生物制品股份有限公司），牛血清白蛋白Ⅴ（BSAⅤ）、小牛血清（FCS）（上海伯奥生物科技有限公司）。　1.3兔血清中总IgG和总IgA的提取纯化［13］　总IgG提取纯化:取免疫兔血清,经常规33%硫酸铵盐析法粗提IgG型免疫球

8、蛋白,透析除盐后再分批过DEAE52纤维素层析柱，用0.01mol·L-1pH7.4PBS洗脱，收集洗脱液，经聚乙二醇浓缩