湖南大围子猪sladr基因克隆及其生物信息学分析

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1、湖南大围子猪SLADR基因克隆及其生物信息学分析：王燕,邢晓为,薛立群,黄生强,吴晓丽,王维【摘要】目的:研究湖南大围子猪SLADR基因特性,评价该猪种在异种器官移植中是否具有应用前景。方法:应用RTPCR扩增大围子猪SLADRA和SLADRB基因,插入pUCMT载体,双向测序,用NCBI中的BLAST和ExPASY软件进行生物信息学分析。结果:大围子猪SLADRA和SLADRB基因扩增片段大小分别为1177bp和909bp,均包含完整的开放阅读框,分别编码252和266个氨基酸残基。生物信息学分析结果表明,大围子猪SLADRA和SLA

2、DRB与人类相应的DRA、DRB相比,氨基酸同源性分别为82%和73%。SLADRα链与人CD4分子结合部位介于第124至136位氨基酸,大围子猪SLADRA在该结合区域与人类相应的DRA存在两个氨基酸差异,即:第127位(lle→Val),第136位(Ser→Thr);SLADRβ链与人CD4分子结合部位位于第134至148位氨基酸,大围子猪SLADRB在该结合区域与人类相应的DRB相比氨基酸序列完全相同。与国际GenBank已登录的许多猪种相比,SLADRA基因同源性高达100%,而SLADRB基因在各猪种之间具有很高的多态性。结论:克隆湖

3、南大围子猪SLADRA和SLADRB基因,该基因与人类相应的HLADRA和HLADRB基因高度同源,提示该猪种有望作为异种移植的候选供体。【关键词】SLADR基因;湖南大围子猪;基因克隆;异种移植　　[Abstract]AIM:ToevaluatethepotentialofDapigstohumansbyanalyzingthecharacteristicsofSLADRgenesinHunanDaplifiedbyRTPCR,clonedintopUCmTvectors,sequencedandanalyzedthroughBLAST

4、inNCBIandrelatedsofte(ORF)andencode252and266aminoacidsrespectively.paringtheSLADRAandSLADRBgenesan,thehomologiesofaminoacidsequencesinoacidsinSLADRαchainofDaposition124to136,anCD4,shoinoacidsinSLADRβchainofDaposition134to148,anCD4,orphismologyofSLADRAgeneisupto100%.CONCLUSION:

5、TheclonedSLADRAandSLADRBinHunanDaorphisman,indicatesthatDaeadvantagesasxenotransplantationdnorsfrompigstohumans.　　[Keyajorhistopatibilityplex,MHC),又称作猪白细胞抗原(sentas公司;pUCMT载体、引物、电泳试剂等购自上海生工生物工程技术服务有限公司;PCR高保真克隆酶EasyA购自Stratagene公司;DNAmarker(100bpladder)购自晶美生物工程公司;湖南大围子猪来自湖南望城大

6、围子猪保种基地。　　1.2方法　　1.2.1湖南大围子猪SLADRA和SLADRB基因引物设计根据GenBank数据库中已登录的明尼苏达小型猪(MinnesotaminiaturesL/L乙醇消毒耳尖取耳样组织,按RNA抽提试剂盒(Gentra公司)说明书方法提取总RNA。测定每一样品总RNA的浓度,模板定量为1μgRNA,按RevertAidTMFirststrandcDNASynthesiskit说明书方法逆转录合成cDNA第一链。以合成的cDNA为模板进行PCR扩增,20μLPCR反应体系中,分别加入下列物质:DEPC处理水13.5μL,PCR

7、缓冲液2μL,25mmol/LMgCl21.6μL,10mmol/LdNTP混合物0.5μL,50mmol/L上、下游引物各0.2μL,模板1.6μL,EasyA高保真酶0.4μL。在PE9700型PCR扩增仪上完成PCR扩增,扩增条件如下:先95℃预变性2min30s,94℃变性40s,58℃～59℃退火40s,72℃延伸40s,完成35个循环,最后72℃延伸5min,置4℃保温。取3.5μLPCR扩增产物,1.5g/L琼脂糖凝胶电泳,以鉴定PCR扩增结果。　　1.2.3湖南大围子猪SLADRA和SLADRB基因克隆与鉴定连接反应在10μL体系中

8、进行:双蒸水3μL、PCR产物1μL、pUCmT载体1μL混匀后加入5μLSo