人tshr膜外区cdna克隆及真核表达载体的构建

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1、人TSHR膜外区cDNA克隆及真核表达载体的构建【关键词】人TSHR膜外区；RTPCR；真核表达载体在自身免疫性甲状腺疾病(autoimmunethyroiddisease,AITD)发病过程中，促甲状腺激素受体(thyrotropinreceptor,TSHR)是重要的自身抗原[1]，机体产生针对TSHR的自身抗体(thyrotropinreceptorantibody,TRAb)是其主要的发病机制。由于存在于甲状腺细胞膜上的TSHR数量少，结构不稳定，且难以纯化，无法开展TSHR的进一步研究。本文从人甲状腺中提取RNA，通过逆转录获得T

2、SHR膜外区cDNA，构建真核表达载体，建立了有效的TSHR体外表达系统。　　1材料与方法　　1.1组织和实验材料　　甲状腺组织于已确诊的Graves手术患者。DH5α感受态细菌购于北京鼎国生物技术有限公司，pMD18T克隆载体系日本TaKaRa公司产品，真核表达载体pcDNA3.1(+)系美国Invitrogen公司产品。RNAgentsTotalRNAIsolationSystem和AccesssRTPCRSystem为Promega公司产品，质粒提取及凝胶回收试剂盒为上海博亚生物公司产品。　　1.2PCR引物的设计合成　　根据文献

3、报告人促甲状腺激素受体cDNA序列资料[2]，由上海华诺生物科技有限公司设计并合成一对用于扩增hTSHR膜外区cDNA编码区的寡核苷酸特异性引物：上游引物为5′ATTGGATCCAACATGGATATGAGGCCGGCGGACTTGCT3′，下游引物为5′GCCGAATCCCTACTTGTAGCCCATTATGTCTTCACAC3′。　　1.3总RNA的提取　　冻存的约100mg甲状腺组织在盛有液氮的研钵中充分破碎，研磨成匀浆，按试剂盒说明逐步加入裂解液醋酸钠、酚氯仿异丙醇，抽提组织中的总RNA，经乙醇漂洗后溶于无RNA酶灭菌去离

4、子水。利用分光光度器测定RNA的A260和A280值。　　1.4RTPCR及产物的纯化　　RNA样品预处理于75℃变性5min后速放冰上冷却。RTPCR反应体系：AMV反转录酶(5u/μL)1μL，TfiDNA聚合酶(5u/μL)1μL，5×AMV/TfiBuffer10μL，上下游引物各3μL，最后混合RNA样品加无RNA酶灭菌去离子水至50μL。混匀后置PCR仪上，逆转录反应条件设为：48℃逆转录60min，94℃预变性2min。PCR反应条件为：94℃变性30s，60℃退火60s，68℃延伸270s，45个循环后，68℃终延伸10m

5、in。对RTPCR产物经乙醇沉淀法进行纯化浓缩。　　1.5克隆质粒的构建　　根据TA克隆原理[3]将TSHR膜外区片段插入pMD18T克隆载体。将TSHR膜外区(thyrotropinreceptorectodominant,ETSHR)片段3μL(约75ngDNA)，pMD18T克隆载体1μL(约50ngDNA)，T4DNA连接酶0.5μL，10×连接酶缓冲液5μL，加去离子水至10μL，至PCR仪上16℃过夜。将连接产物转入DH5α细菌，经IGTP/Xgal平皿(Amp+)筛选，挑选单个白色菌落，放入10mLLB培养液中，37℃振摇

6、过夜。碱裂解法提取重组质粒，双酶切法筛选携带目的片段的阳性克隆子并纯化。　　1.6真核表达载体的构建及鉴定　　将上一步提纯的pMDETSHR重组质粒双酶切后，定向插入pcDNA3.1(+)质粒。反应体系为pMDETSHR重组质粒5μL，10×KBuffer2μL，BamHⅠ和EcoRⅠ各1μL，加水至10μL。将酶切体系37℃过夜，65℃15min使灭活内切酶。经凝胶电泳后分离目的片段ETSHR，提纯浓缩后加入真核表达载体pcDNA3.1(+)，再建立连接体系。连接产物导入感受态细胞，涂于琼脂平板(Amp+)，挑选阳性克隆，酶切电泳分析，

7、并送上海华诺生物科技公司鉴定。　　2.3真核表达载体的酶切鉴定结果　　酶切电泳后，出现分子量约5420bp和1245bp的两条特异性DNA片段，其中的小片段与PCR产物一致，表明获得正确克隆(图2)。　　2.4测序结果　　克隆片段为1245bp的ETSHR编码区，与已发表的序列完全一致[2]，证实有包括起始密码子和kozak序列的完整ETSHR正确插入pcDNA3.1(+)质粒中。　　3讨论　　Nagayama于1989年利用G蛋白耦联受体家族中各受体间具有相似的结构和功能的特点，首先分离出了完整的人TSHRcDNA克隆。主要存在于甲状腺细胞

8、膜上的TSHR蛋白含量较少，且结构不稳定，建立TSHR体外表达系统成为解决问题的关键。原核重组蛋白缺乏正常空间结构和糖基化，很快被真核表达系统所取代。TSHR体外表