木犀草素体内抗炎作用机制研究

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1、木犀草素体内抗炎作用机制研究：张毅，王旭光，杨展，何惠娟【摘要】目的探讨木犀草素(Lut)的体内抗炎疗效及作用机制。方法采用角叉菜胶致大鼠足爪肿胀模型，观察Lut对足爪肿胀度的影响；酶免疫测定法(EIA)测定炎足足跖部的渗出液前列腺素E2（PGE2）的含量；免疫组织化学法(IHC)及免疫印迹(ethodsThemodelofcarrageenaninducededemaofrathindpaamodelethasone(forapositivecontrol).ThePGE2contentintheedemaexudateeasuredbyEIA.The

2、COX2expressionoftheedemapamunohistochemistryandapamatoryeffectonratinflammationinducedbycarrageenanprobablythroughthemechanismsoftheinhibitionofCOX2proteinexpressionandofPGE2production.　　Keymation；prostaglandinE2　　木犀草素(Luteolin，Lut)属于黄酮类化合物，主要存在于菊花、忍冬花、紫苏叶等天然药物，近年研究表明Lut具有抗氧化、抗肿

3、瘤、抗炎、免疫调节等作用［12］。我们研究发现Lut在体外能抑制环氧合酶2(COX2)mRNA及蛋白表达，同时降低NFκB的DNA结合活性和蛋白表达［3］，其抗炎机制可能与此有关。为进一步探讨Lut的抗炎作用机制，我们建立大鼠足爪肿胀炎症模型，研究Lut对炎症大鼠COX2表达及前列腺素E2（PGE2）生成的影响。1材料和方法1.1材料清洁级雄性SD大鼠，体质量150～250g，由广东医学院实验动物中心提供。角叉菜胶、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺等为美国Sigma公司产品；Lut（纯度>98%）和PGE2EIAKit为美国Cayman公司产品；β

4、actin山羊IgG多克隆抗体、COX2山羊IgG多克隆抗体、免疫组化SP试剂盒均为北京中山公司产品；PVDF膜为美国PallGelman公司产品。1.2方法　　1.2.1大鼠分组　　50只大鼠随机分为5组，分别为空白对照组、2mg/kg地塞米松(Dex)阳性对照组及40、80、120mg/kgLut3个剂量组，每组10只。实验时分别腹腔注射等体积生理盐水、地塞米松及40、80、160mg/kg剂量的Lut。　　1.2.2大鼠足爪肿胀测定　　腹腔注射给药30min后于大鼠右后足跖皮下注射1%角叉菜胶0.1mL/只致炎，分别在致炎前，致炎后0.5、1、

5、2、3、4、5h用大鼠足爪容积测定仪测量炎足爪容积，计算各组大鼠不同时间点足爪肿胀度。肿胀度(mL)=致炎后右后足容积－致炎前右后足容积。　　1.2.3大鼠足爪炎性渗出物中PGE2含量的测定　　大鼠右后足致炎5h后处死大鼠，于大鼠右踝关节处剪下足爪，称重剥皮浸泡于5mL生理盐水中浸泡30min，取出足爪，离心浸泡液15min(3000×g)，取上清液0.5mL，以PGE2EIAKit测定其中的PGE2含量(μg/g)，并计算抑制率。　　抑制率IR(%)=对照组PGE2含量-给药组PGE2含量对照组PGE2含量×100%　　1.2.3g加入0.2mL细胞裂解

6、液在匀浆器中匀浆后，将裂解液于冰上超声破碎细胞（10s/次×3次，间隔15s），4℃，12000g离心10min,收集上清液，考马斯亮蓝（G250）染色法测上清液蛋白质含量。每组各取50μg蛋白质样品加上样缓冲液煮沸变性后，进行10%SDSPAGE；电转移至PVDF膜；用含5%脱脂奶粉的TBS(PH8.0)封闭2h；分别加入适量COX2和βactin多克隆抗体，摇床上室温反应2h；洗膜3次每次20min；加辣根过氧化物酶标记的二抗，室温反应2h；洗膜后作ECL化学发光，X片曝光显影。图像经扫描仪扫描后，用图像分析软件BandScan5.0进行光密度积分

7、值分析，计算目的蛋白与内参照βactin蛋白表达量的光密度积分值之比作为目的蛋白表达量的相对含量值。　　1.2.4免疫组织化学（IHC）　　取足跖部位的组织，用10%中性缓冲福尔马林及时固定，石蜡包埋，切片，贴片，常规脱蜡。0.1mol/LPBS(pH7.4)浸泡5min。微波修复抗原。滴加正常山羊血清封闭液(试剂B)，室温20min。滴加1:50稀释的COX2羊IgG单克隆抗体，阴性对照以PBS代替一抗，于4℃孵育过夜。PBS洗3次。滴加链霉菌抗生物素过氧化物酶溶液(试剂C)，室温孵育10min，PBS冲洗3次。滴加试剂SABC(试剂D)，37℃，

8、30min，PBS冲洗3次。DAB显色。苏木素轻度复染。脱水，透明