肾癌osrc2细胞cd133的表达及意义

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1、肾癌OSRC2细胞CD133的表达及意义：田福起孙浩,潘鹏,郭涛【摘要】目的：培养肾癌干细胞球，研究其表面分子特性。方法：肾癌细胞悬浮于含有表皮生长因子(epidermalgroa(RCC)stemcellsinserumfreemedium(SFM)ethodofsuspensioncultureandtoresearchtheirpropertyofsurfacemoleculesonthecells.Methods：RCCcellsSFMetry.Results：RCCstemcellsspheresorespherescameout.Thencollectedanddet

2、ectedthembyfloetry.hadhigherexpressionofCD133.　　[Keyorstemcell;renalcellcarcinoma(RCC);cellculture;CD133;CD34　　肿瘤干细胞的鉴定主要利用细胞特异表面标志及侧群(sidepopulation,SP)检测。目前已相继从白血病、乳腺癌、脑胶质瘤等多种肿瘤组织中得到了相应的肿瘤干细胞。本文旨在运用无血清培养基培养肾癌细胞，流式细胞仪鉴定其CD133，CD34的表达，明确肾癌干细胞的表面标志。　　1材料与方法　　1.1仪器与试剂　　CO2培养箱(上海力康)、流式细胞分析仪(BD公司)、

3、超净工作台(苏州安泰)、AnkeTDL5A离心机(上海安亭);肾癌细胞株OSRC2(上海中科院细胞库);DMEM高糖培养液(GBICO)、F12培养液(GBICO)、胎牛血清(杭州四季青)、bFGF(Prospec)、EGF(Prospec)、antiCD133PE(eBioscience)、antiCD34-FITC(Sigma)。　　1.2方法　　1.2.1肾癌干细胞球的培养取对数生长期的肾癌细胞OSRC2，用0.25%的胰酶消化，倒置显微镜下观察，待细胞由梭形变为圆形时加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液终止消化;收集细胞，1500r/min离心5min;

4、弃去上清，PBS漂洗1次，重新悬浮于预先配好的DMEM/F12无血清培养基(含EGF20μg/L,bFGF20μg/L);以终浓度2×105活细胞/ml接种于75cm2底面积培养瓶，在37℃，5%CO2培养箱进行悬浮培养，隔日换液;同时以高糖DMEM培养液培养细胞作为阴性对照。倒置显微镜下观察生长情况。　　1.2.2流式细胞仪检测CD133及CD34的表达收集无血清培养7天的肾癌细胞球，1500r/min离心5min，弃上清，用0.25%的胰酶将其消化成单细胞;1500r/min离心5min收集细胞;弃去上清，PBS漂洗3次;加入PE标记的antiCD133，FITC标记的anti

5、CD34各20μl，室温避光孵育20min后PBS漂洗1次，用抗鼠IgG1作同型对照进行流式细胞分析。同时收集阴性对照细胞进行流式分析。　　1.2.3肾癌干细胞球的分化培养收集无血清培养7天的肾癌细胞球，重悬于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，接种于25cm2底面积培养瓶，37℃，5%CO2培养箱进行培养，倒置显微镜下观察生长情况。　　1.3统计学处理　　CD133及CD34的表达用均数±标准差(±s)表示，应用SPSS13.0统计软件进行配对t检验，P<0.05为差异有统计学意义。　　2结果　　2.1肾癌干细胞球培养生长过程观察　　肾癌细胞接种于无血清培养基后可见细胞呈

6、圆形悬浮于培养液;10h后大部分细胞沉于瓶底，并有部分贴壁生长，仍有少量细胞悬浮;2d后可见有细胞球的生成，每个细胞球大约有3～8个细胞，呈圆形，规则无突起，折光性较强;7d后，细胞球明显增多，体积增大，致密，为规则的圆形或卵圆形(图1)。对照组细胞则贴壁生长，呈梭形或多角形，均匀散布于瓶底，没有细胞球的生成(图2)。　　2.2肾癌干细胞球CD133及CD34的表达情况　　通过流式细胞分析可见悬浮培养的肾癌干细胞球中CD133高表达、CD34几乎不表达，存在(8.33±1.26)%的CD133+CD34-细胞(图3)，而正常培养的肾癌细胞只有(1.24±0.36)%(图4)，差别有统

7、计学意义(t=-19.71，P<0.05)。　　2.3肾癌干细胞球的分化过程观察　　肾癌干细胞球悬浮于有血清培养液2天后可见致密的细胞球疏松分散，贴于瓶底，细胞呈梭形或多角形，生长特点基本同无血清悬浮培养前相同，CD133及CD34表达情况也基本与阴性对照相同，差别无统计学意义(t=0.39，P>0.05)。　　3讨论　　肾细胞癌(renalcellcarcinoma,RCC)的发病率在全身恶性肿瘤中占3%左右，在泌尿系统肿瘤中占有重要地位[1