5azacdr对人肾癌osrc2细胞生长及γ连环蛋白表达的影响

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1、5AzaCdR对人肾癌OSRC2细胞生长及γ连环蛋白表达的影响：陶美满，孙浩，田福起，马克钧，郭涛，潘鹏，徐强【摘要】目的：研究甲基化抑制剂5氮杂2′脱氧胞苷（5AzaCdR）对人肾癌OSRC2细胞增殖、凋亡及γ连环蛋白（γcatenin）表达的影响。方法：使用不同浓度（10-7，10-6，10-5,10-4mol/L）的特异性DNA甲基转移酶抑制剂5AzaCdR处理OSRC2肾癌细胞株。MTT检测5AzaCdR对肾癌细胞株OSRC2的生长抑制作用。流式细胞仪检测5

2、AzaCdR对OSRC2肾癌细胞株凋亡的影响。细胞免疫化学检测5AzaCdR处理OSRC2肾癌细胞株后γcatenin表达的变化。结果：5AzaCdR明显抑制肾癌细胞的增殖，促进其凋亡，且与药物浓度及作用时间有关。药物处理后γ连环蛋白表达增加。结论：γcatenin蛋白表达受甲基化的抑制，提示5AzaCdR可使γcatenin基因去甲基化而抑制肾癌OSRC2细胞株增殖，并促进其凋亡。【关键词】5氮杂2′脱氧胞苷；肾癌；γ连环蛋白；细胞凋亡;甲基化［Abstract］

3、Objective:Toinvestigatetheeffectofmethylationinhibitor5Aza2deoxycytidineonthegroanrenalcancercelllineOSRC2andγcateninexpression.Methods：HumanrenalcarcinomaOSRC2cellsol/L）respectively.Thenthegroetry.Theimmuneocytochemistryentent.γcateninexpressionle

4、velsinOSRC2cellsent.Conclusion：γcateninexpressionlevelsethylation,5AzaCdRcaninhibitthegrootetheapoptosisofOSRC2cellsbyinducingdemethylationinthepromoterregionofγcateningene.［Keya;γcatenin;cellapoptosis;methylation肾细胞癌的发病率居泌尿系统肿瘤的第二位，目前的治疗仍以根治性手术为主，

5、但术后复发率达20%以上，且放、化疗效果不佳，因此迫切需要早期诊断方法和其他有效的治疗［1］。肾细胞癌的发生、发展与多种因素有关,抑癌基因失活是关键因素之一。研究表明,抑癌基因失活的主要方式有基因的缺失、突变和启动子区域的过甲基化等［2］。γ连环蛋白(γcatenin)是一种多功能蛋白质，近年研究显示γcatenin蛋白在多种肿瘤中表达减少,国外有研究证实在肾癌组织及细胞其表达明显下调［3］,启动子区域CpG岛的过甲基化可能是其失活的主要方式,国内尚无相关的研究。我们采用5氮杂2′脱氧胞苷(5A

6、zaCdR)对肾癌细胞株进行处理,检测γcatenin表达,进一步研究肾癌细胞中γcatenin表达下降是否与基因甲基化有关，探索上调或恢复肾癌细胞中γcatenin正常表达的可能机制。1材料与方法1.1材料人肾癌细胞株OSRC2购于上海细胞生物所；胎牛血清（杭州四季青）；DMEM培养基、胰酶、DAB显色试剂盒及SABC试剂盒（武汉博士德）；5AzaCdR（Sigma公司），用PBS充分溶解后保存于70℃冰箱备用；兔抗人γ连环蛋白多克隆抗体、MTT及二甲亚砜（Sigma公司）；凋亡检测试剂

7、盒(美国BD公司)。1.2方法1.2.1细胞培养人肾癌细胞株OSRC2用含10％胎牛血清的DMEM培养液培养（37℃，5％CO2，饱和湿度），隔日换液，细胞长满培养瓶壁的80％～90％后，按照1∶3传代，取对数生长期的细胞进行试验。1.2.2MTT法检测细胞增殖活性对数生长期细胞以每孔5000个细胞密度接种于5块96孔板中,过夜贴壁后,加入不同浓度的5AzaCdR,每孔180μl,每组设5个复孔,并设不加药的对照孔和不接种细胞的调零孔。药物和培养液每24h更换1次,每天取出1板,加入5g/L的MTT溶

8、液20μl,37℃，5％CO2培养箱中继续培养4h后弃去上清,每孔加入150μlDMSO,振荡10min充分溶解结晶,置酶联免疫检测仪上测定波长490nm下的光密度值，细胞生存率以平均光密度（D）值分析，以D值为纵坐标，以时间（h）为横坐标，绘制生长曲线图。1.2.3流式细胞仪检测细胞凋亡按照试剂盒的说明操作，收集药物处理后的细胞，用PBS洗涤2次,缓冲液调整细胞浓度为106/ml，取100μl加入