年龄因素对大鼠脂肪干细胞成骨诱导分化能力的影响

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1、年龄因素对大鼠脂肪干细胞成骨诱导分化能力的影响【关键词】组织工程脂肪干细胞年龄成骨分化种子细胞的选择是骨组织工程的基础和关键之一。骨髓间充质干细胞（Bonemarroalstemcells.BMSCs）作为骨组织工程种子细胞已经广泛应用。但骨髓采集量有限，大量抽取会增加机体损伤，并有一定并发症[1]，因此不利于临床大规模的培养与应用。2001年Zuk等[2]通过脂肪抽吸术获得脂肪干细胞(Adipose-derivedstemcells,ADSCs)。ADSCs具有丰富、易于获取[3]、自体移植可以避免排斥反应、并且具有分化为多

2、种中胚层细胞[4]及跨胚层分化[5]等优点，大量研究证实ADSCs在体外培养可以稳定增殖和传代并具有向成骨细胞系分化的能力[6,7]，但是不同年龄段ADSCs的生物学性状不尽相同，若ADSCs成为骨组织工程中理想的种子细胞还应考虑到，年龄因素对细胞增殖及成骨能力的影响，本研究探讨不同年龄阶段ADSCs的成骨分化能力及其机制。为ADSCs是否可以成为理想的种子细胞及为临床应用提供依据。1材料与方法1.1实验动物及分组健康SD大鼠30只，雌雄不限，按年龄分为幼年组（1月龄）、成年组（12月龄）和老年组（24月龄），每组10只，体重

3、分别约为150、400和750g。1.2主要试剂DMEM(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，Ⅰ型胶原酶(Sigma)，β—甘油磷酸钠(Sigma)，地塞米松，抗坏血酸，ALP试剂盒(南京建成)，钙含量测定试剂盒(Sigma)。1.3不同年龄段ADSCs分离培养取SD大鼠，脱颈处死，75%乙醇消毒，无菌条件下取腹股沟部及肾下脂肪组织，去除肉眼可见的血管及其它组织，用PBS反复冲洗3次，将脂肪组织剪成大约1mm3小块，置0.1%Ⅰ型胶原酶中，37℃摇床100r/min消化60min，然后1000r/min，离心10min，弃去

4、上层脂滴及上清，沉淀用含10%胎牛血清的DMEM培养基制成单细胞悬液。进行细胞计数，以2×105/mL的密度接种于培养瓶中，置37℃、5%CO2、饱和湿度的恒温培养箱中常规培养。原代培养每3天换液。待细胞融合达80%时，吸除原代细胞培养液，加入2mL0.125%胰酶-EDTA消化液消化。当观察到细胞突起回缩，形态变圆，细胞间隙增大时，加入2mL含10%胎牛血清的DMEM中和胰酶的消化作用，用吸管反复吹打，制成单细胞悬液，移入离心管中；1000r/min离心5min，弃上清，加入7mL含10%胎牛血清的DMEM培养基，吹打制成均

5、匀的细胞悬液，之后1:2传代、扩增培养。1.4不同年龄段ADSCs成骨能力检测1.4.1ADSCs成骨诱导培养取第3代细胞经消化后加入含有0.1μmol/L地塞米松、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50μmol/L抗坏血酸的成骨诱导剂的DMEM培养基，每3天换液。以加入不含诱导剂培养基的3代细胞作为对照组。1.4.2细胞凋亡率检测将成骨诱导14d的细胞用0.125%胰蛋白酶-0.01%EDTA消化液消化，调整细胞密度密度为1×106/mL,取1mL细胞，1000rpm离心10min，弃上清。加入1mL预冷的PBS震荡重悬，10

6、00rpm离心10min，弃上清。将细胞重悬于200μLBindingBuffer，加入10μLAnnexinV-FITC和5ULPI，混匀，室温避光反应15min，加入300μLBindingBuffer，上机检测。1.4.3碱性磷酸酶(ALP)活性测定将第3代细胞以1×104/孔的密度接种到24孔板。分别在诱导4、8、12、16、20d，每次各年龄组及对照组各取6孔，按ALP试剂盒要求检测ALP活性。在520nm波长处测定各孔吸光度并根据公式计算ALP含量，结果表示为金氏单位U/100mL。1.4.4钙离子浓度测定取成骨诱

7、导7、14、21d细胞各1板，用PBS洗两遍，每孔加入lmL0.5mol/LHCI，振荡过夜，次日以1000rpm离心10min，上清液用钙试剂盒测定钙含量。每份上清液取20μL，按试剂盒说明进行操作，于575nm波长处测吸光度值，结果表示为μg/孔。1.5统计学分析采用SPSS13.0进行统计处理。所有数据采用x±s表示。组间比较采用单因素方差分析及q检验。方差不齐组经数据转换后再进行方差分析。2结果2.1细胞形态学观察不同年龄阶段大鼠的ADSCs接种后在悬液中细胞呈圆形，不能辨认细胞核。各组在原代培养48h，可见多数细胞贴

8、壁，细胞呈星形，胞体较小。培养第5天，各组细胞形态无差别均呈梭形，幼年组细胞胞体较小，数量多，形成集落明显，克隆性生长(图1)；成年组细胞数量较多，克隆性生长(图2)；老年组细胞胞体稍大，数量少，散在分布(图3)。细胞增殖速度随年龄的增加而降低，幼年组原代培养第5天细胞达到8