人masp1 n端片段原核表达载体的构建及其表达

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1、人MASP1N端片段原核表达载体的构建及其表达：蔡学敏,赵娜,左大明,张丽芸,陈政良【摘要】　　目的:在大肠杆菌中表达人甘露聚糖结合凝集素（MBL）相关丝氨酸蛋白酶1（MASP1）N端片段。方法:采用PCR技术从含人MASP1cDNA的质粒pGEMMASP1中扩增MASP1N端基因片段,将其插入原核表达载体pGEX4T1,转化BL21(DE3)感受态菌诱导表达MASP1N端蛋白,通过GSTrap亲合层析柱纯化目的蛋白,以SDSPAGE和BLCLR、重组MBL的结合活性。结果:从pGEMMASP1中扩增得到约860bp的基因片

2、段,构建成重组载体经酶切出现约4900bp和860bp片段,测序结果与预期的完全一致。纯化蛋白经SDSPAGE可见Mr60000蛋白带,该蛋白可与抗GST抗体反应并能与重组人MBLCLR、重组人MBL蛋白结合。结论:获得了表达人MASP1N端片段的大肠杆菌菌株和重组人MASP1N端片段/GST融合蛋白,为MASP1分子的进一步研究提供了条件。【关键词】甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶1N端片段原核表达　　[Abstract]AIM:ToexpresstheNterminalfragmentofhumanmannanbinding

3、lectin(MBL)associatedserineproteases1(MASP1N)inE.coli.METHODS:ThetargetsequenceinpGEMMASP1plasmidthatcontainshumanMBLMASP1cDNAplifiedbyPCR,insertedintoprokaryoticexpressionvectorpGEX4T1andidentifiedbyrestrictionmappingandsequencing.TherebinantexpressionvectoredintoE.

4、coliBL21(DE3)cells.TheexpressedproductmobilizedMetalAffinityChromatography(IMAC)andidentifiedbySDSPAGEandBL(MBLCLR)andanMBLelinkedimmunosorbentassay（ELISA）.RESULTS:TheDNAfragmentof860bp,inalregionofhumanMASP1,plifiedfrompGEMMASP1plasmidandtherebinantexpressionvector,p

5、GEX4TMASP1N,apsandsequenceanMBLCLRandhumanMBLintheindirectELISA.CONCLUSION:TheprokaryoticcellstrainthatexpressesefficientlyrebinanthumanMASP1N(rhMASP1N)proteinandthepurifiedrhMASP1Nproteinolecule.　　[Keyannanbindinglectinassociatedserineprotease1;Nterminalfragment

6、;prokaryoticexpression　　甘露聚糖结合凝集素（mannanbindinglectin,MBL）是由肝细胞分泌的血浆蛋白,在血循环中与MBL相关丝氨酸蛋白酶（MBLassociatedserineprotease,MASP）形成复合物而发挥功能。MBL的糖识别域（carbohydraterecognitiondomain,CRD）能选择性识别多种病原体表面的糖结构,而胶原样区（collagenlikeregion,CLR）为其效应功能区,结合MASP的功能定位于此区。MBL与糖基配体结合后,勿需C1和抗体参与即

7、可通过MASP激活补体系统,此即补体激活第三途径——凝集素途径[1-3]。MASP1属于丝氨酸蛋白酶（serineproteases,SP）超家族成员,为含6个功能区的单肽链分子:从N端至C端依次为CUB区（plementsubponentC1r/C1slikedomain）、EGF区（epidermalgroain）、CUB区、CCP区（plementcontrolproteindomain）、CCP区和SP区。初步研究表明,MASP1N端的CUB和EGF区涉及与MBLCLR的结合[3]。为了深入研究MBL与MASP1结合的活性位点,

8、阐明MBL与MASP1相互作用从而激活凝集素途径的机制,我们构建了MASP1N端片段（包括CUBEGFCUB区）的原核表达载体,在大肠杆菌中高效表达MASP1N端蛋白。　　1材料和方法