mfshr基因n端片段的序列分析、原核表达载体构建及其表达

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1、mFSHR基因N端片段的序列分析、原核表达载体构建及其表达：黄海雁，文梦灵，张惠玲【摘要】目的：克隆小鼠卵泡刺激素受体(FSHR)基因N端部分片段(2890aa)(mFSHRn);预测其编码蛋白作为候选避孕疫苗的可行性;构建原核表达重组质粒，并在大肠杆菌中表达。方法：提取小鼠睾丸组织总RNA，利用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)技术反转录成cDNA，按照GeneBank中小鼠FSHRN端序列设计引物，扩增基因片段并插入pET32a载体，测序鉴定后做生物信息学分析;质粒转化E.coliBL21(DE3)感受态菌株诱导表达蛋白。结果：扩增片段长度为186bp,测序结果与预期结

2、果完全一致，生物信息学分析其编码蛋白具有良好的抗原性;重组原核表达质粒经鉴定获得正确重组子并诱导表达。结论:mFSHRn蛋白可作为良好的候选避孕疫苗，成功构建了pET32amFHSRn原核表达重组质粒，获得可表达mFHSRn的大肠杆菌菌株，为后续的相关研究奠定了基础。【关键词】卵泡刺激素受体;原核;表达;生物信息学分析Objective:ToclonefolliclestimulatinghormonereceptorgeneNterminalfragment(2890aa)(mFSHRn),andtoforecastthepossibilityofitsencodingpro

3、teinbeingpregnancyvaccine,andtoconstructprokaryoticexpressionrebinantplasmidandexpressitincolibacillus.Methods：MousetestisRNAeansofRTPCR.TheprimerouseFSHRNterminalsequenceofGenebank,andthengenefragmentsplifiedandpET32avectoraticsidtransformationE.coliBL21(DE3)petencestrain.Results：Theamplific

4、ationlengthaticsanalysisshoidobtainedreconandinducedexpression.Conclusion：mFSHRnproteincanbeareliablecandidateofpregnancyvaccine.核酸酶抑制剂为TaKaRa公司产品;DNA凝胶纯化试剂盒、质粒DNA小量抽提试剂盒为Omega公司产品;TRIzol试剂、MMLV逆转录酶为Invitrogen公司产品;HRP抗His抗体为晶美公司产品;其他试剂均为分析纯。　　1.2方法　　1.2.1序列的生物信息学分析用VectorNTI9.0软件预测FSHRn片段编码蛋

5、白的疏水性、柔韧性、抗原性、亲水性和极性肽段，并对其二级结构进行预测分析。采用BLAST在线工具对鼠FSHR基因的核苷酸序列进行同源性比较。　　1.2.2睾丸总RNA提取酒精浸泡小鼠数分钟，仰面固定，取出睾丸，去除白膜与大血管，用TRIzol试剂提取睾丸总RNA，-80℃保存备用。　　1.2.3PCR引物设计根据GeneBank/NCBI:NM_013523.2小鼠部分基因序列(2890aa)，经PrimerPremier5.0软件分析设计引物：　　P2：CGCCTCGAGATCTGCCTCTATTACCTCCAAG，引物1和2分别引入EcoRI、XhoI酶切位点和保护性碱基,便

6、于亚克隆，扩增片段长度186bp，引物由上海英骏生物技术有限公司合成。　　1.2.4目的基因PCR产物的扩增和纯化用MMLV逆转录酶合成cDNA第一链，20μL体系：先将250ng的随机引物、2μL总RNA、1μL10mmol/LdNTP混合物加入无核酸酶的微量离心管中，加灭菌蒸馏水至12μL，混合物65℃加热5min，迅速置于冰上冷却。短暂离心后加入：4μL5×第一链合成缓冲液、2μL0.1mol/LDTT、1μLRNaseOUTTM核酸酶抑制剂(40U/μL);在离心管中轻轻混和各种成分，并在37℃下孵育2min。室温下加入1μLMMLV逆转录酶，轻轻吹打混匀，在25℃下孵

7、育10min,最后37℃孵育50min。采用20μL反应体系，以2μLcDNA(500ng/μL)为模板，以94℃5min;94℃30s,60℃30s,72℃30s,扩增30个循环;最后72℃延伸7min为条件扩增，PCR产物使用2%琼脂糖凝胶电泳观察扩增片段大小。DNA凝胶纯化试剂盒凝胶回收扩增的PCR产物，-20℃保存备用。　　1.2.5大肠杆菌感受态细胞的制备按分子克隆实验技术操作[5]。　　1.2.6原核表达载体pET32amFSHRn的构建将PCR产物和p