蜂毒素诱导人成骨肉瘤细胞凋亡的机制探讨的论文

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1、蜂毒素诱导人成骨肉瘤细胞凋亡的机制探讨的论文【关键词】蜂毒素蜂毒素是蜂毒的主要成分，具有多种生物学活性，近年来的研究揭示了其抗肿瘤作用，引起了人们的广泛关注，有研究显示蜂毒素对肝癌bel7402、smmc7721、hep3b［1,2］、t淋巴细胞白血病6tcem［3］等多种肿瘤细胞具有明显的增殖抑制及诱导凋亡作用，但目前蜂毒素诱导肿瘤细胞凋亡的机制还不十分清楚。本研究观察了蜂毒素对人骨肉瘤u2os细胞生长增殖抑制和诱导细胞凋亡的作用，探讨了线粒体膜电位及凋亡相关蛋白bcl2、bax表达变化，旨在探讨其诱导机制。1材料与方法1.1材料1.1.1化学试剂及蜂

2、毒素mem培养基、胎牛血清购自美国gibco公司，胰蛋白酶和rodamine123购自美国sigma公司，鼠抗人bcl2单克隆抗体及bax鼠抗人多克隆抗体购自santacruz公司。蜂毒素由长海医院中医科实验室提取、纯化，用生理盐水配置成1mg/ml，-20℃冷冻保存备用。1.1.2细胞株和细胞培养骨肉瘤u2os细胞株购自中国科学院上海细胞研究所，采用含10％胎牛血清的dmem完全培养基，在37℃、体积分数为5％co2、完全饱和湿度条件下常规培养，用0.25％胰蛋白酶和0.02％edta按1∶1混合的消化液消化细胞，2～3d进行传代培养，取对数生长期细胞进行实

3、验。.1.2实验方法1.2.1mtt法测定细胞增殖抑制率及半数有效抑制浓度（ic50）取对数生长期u2os细胞，以1×104/孔的密度接种于96孔板，常规培养，培养体系为100μl。培养24h细胞贴壁后，设对照组及实验组，每组设6个复孔，实验组分别加入终浓度为1、2、4、8、16和32μg/ml的蜂毒素分别作用12、24、36h。实验结束前4h每孔加入mtt10μl（浓度为5mg/ml），终止实验时取出96孔板，弃上清，滤纸吸干浮液，每孔加dmso150μl，充分溶解，置标仪上测定吸光度a值，测定波长为492nm，按以下公式计算生长抑制率：抑制率＝（对照组a值-实

4、验组a值）/对照组a值×100％应用药物抑制浓度计算软件（loggt法）计算ic50值。1.2.2透射电镜形态观察作用12h后收集细胞，2.5%戊二醛前固定，1%锇酸后固定，常规电镜标本制作，在h600型透射电镜下观察细胞超微结构。1.2.3流式细胞仪检测细胞凋亡率作用12h后，收集细胞并重悬于bindingbuffer（结合缓冲液）中，加荧光标记的annexinv和pi，室温避光孵育15min,流式细胞仪检测细胞凋亡率。1.2.4流式细胞仪测定线粒体膜电位(δψm)的变化作用12h后，消化、收集细胞。pbs洗2次，细胞重悬于0.5mlpbs中，加入rh123使

5、其终浓度为10mg/ml。37℃避光孵育30min，pbs再洗1次，上流式细胞仪检测。1.2.5免疫细胞化学法检测bcl2和bax蛋白表达变化取对数生长期u2os细胞，以2×105个/每孔接种预先置有盖玻片的无菌六孔培养板中，培养过夜后分别加入终浓度为2、4、8μg/ml的蜂毒素，另设无药物处理的空白对照组，继续培养12h，取出盖玻片，按bcl2和bax免疫组化试剂盒操作说明书进行染色、固定。bcl2和bax染色信号均为棕黄色，定位于细胞浆。结果判定方法为光镜下以细胞浆有明显棕黄色为阳性细胞。采用ims计算机细胞图像分析系统进行阳性表达强度的定量分析，光镜下

6、（×250）随机选3个视野，通过预设采样程序得出阳性面积百分比（positivearearate）和平均光密度值（averageodvalue），两者的乘积为免疫细胞化学阳性指数（positiveindex，pi）。1.3统计学方法应用spss11.0对实验数据进行分析，数据结果均采用±s表示，多组间比较先行方差齐性检验，方差齐者进行单因素方差分析，两两比较采用neankeuls检验（q检验）；方差不齐者进行成组秩和检验(kruskalenyi法。2结果2.1蜂毒素对骨肉瘤u2os细胞的生长抑制作用loggt法测得ic50值为7.12μg/ml，在2～8μg/

7、ml浓度范围内对u2os细胞增殖抑制作用具有明显的剂量和时间依赖性，见图1。图1蜂毒素对u2os细胞的生长抑制作用fig1theinhibitiveeffectofmelittinonu2oscellline2.2透射电镜形态观察对照组骨肉瘤细胞染色质均匀分布，细胞核不规则呈多角形，个别细胞胞浆中含有脂滴。蜂毒素2μg/ml处理组细胞胞浆疏松，胞膜隐约可见，染色质边集，出现了典型的凋亡早期超微结构变化。4μg/ml组胞浆散落，染色质凝集，有凋亡小体出现，8μg/ml亦可见凋亡小体，见图2。2.3流式细胞仪检测细胞凋亡率蜂毒素各剂量组产生的凋亡率与对照组相比均有所增

8、高，差异具