细胞实验方案(修改版)

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1、生科3班1组自主实验方案外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备，染色体组型分析一、实验目的1、了解动物细胞培养、传代培养的方法以及培养过程中的无菌操作。掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。2、掌握细胞染色体的制备方法，掌握人类染色体G－带的显示方法及人类染色体G－带在染色体识别中的意义。3、熟悉人类染色体的镜下检查和核型分析方法。初步掌握人类染色体G带的特征及其识别。二、实验原理所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红

2、细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去，最后以气干法制片，可获得较好的染色体。人类外周血细胞本来是终末分化细胞，一般没有分裂能力，但经PHA（植物血球凝集素）或ConA等药物刺激后，转变成可分裂的转化细胞。染色体显带是将染色体标本经过一定程序处理，并用特定染料染色，使染色体沿其长轴显现明暗或深浅相间的横行带纹――染色体带，这种技术，称为染色体显带技术。通过显带，人们可以准确地识别每一条染色体及染色体上的各个区段，并可发现染色体上较细微的结构变化。在所有的显带技术中，G显带（Gbanding）是最常见的显带技术，它是将染色体标本用碱、胰蛋白酶或其它盐溶液处理后，再用Giemsa染

3、液染色，在普通显微镜下，可见深浅相间的带纹，称G带（Gband）。G显带方法简便，带纹清晰，染色体标本可以长期保存，因此被广泛用于染色体病的诊断和研究。正常人类染色体的数目为46条(23对)，1960年的Denver会议和1963年的London会议制定了统一的人类染色体命名体制：按照染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数，将常染色体（22对）按大小用阿拉伯数字标记，顺次排列为1～22号，性染色体用X和Y标记；并按染色体大小和着丝粒位置，把人类染色体分为七个组，用大写字母A～G表示。染色体经显带处理后，每条染色体都显示出其特定的带纹特征（见下表）。根据这些特征，可以准确地识别每条

4、染色体，检出染色体数目或结构畸变。表1人染色体组型及其特征组别染色体序号形态，大小着丝点位置次缢痕随体鉴别程度A1~3最大M;中部着丝粒（1，3）常见1号无可鉴别B4~5次大SM;亚中部着丝粒 无不易C6~12+X中等SM;亚中部着丝粒常见9号无难鉴别D13~15中等SI;近端着丝粒偶见13号有难鉴别E16~18较小16m.17m、18m;中部着丝粒常见16号无可鉴别F19~20小M;中部着丝粒 无不易G21~22+Y最小St;近端着丝粒有有y无难鉴别三、实验试剂与器材试剂：培养基：RPMI1640,含有双抗（青、链霉素）和小牛血清；小牛血清；植物血球凝集素（PHA）；秋水仙

5、素：50ug/ml；磷酸缓冲液：1/15mol/L,ph=6.8；低渗溶液：0.075mol/L氯化钾；Carnoy固定液：甲醇：冰乙酸（3：1）；胰蛋白酶溶液；Giemsa（姬萨姆）染液；75%的酒精、器材：光学显微镜，离心机，恒温水浴箱，恒温箱，离心管，量简，烧杯，培养瓶，载玻片，玻片架，注射器，碘酒和酒精棉球，酒精灯，天平，普通冰箱，立式染缸、染色架、镊子，直头小吸管、橡皮吸头、吸水纸若干，香柏油，擦镜纸，剪子，胶水。正常人类染色体G带核型图，核型报告纸四、实验方法（一）培养液配制实验室配好（二）采血与培养：抽取男生和女生外周静脉血2ml。常规消毒后，立即将针头插入灭菌

6、小瓶内，送入超净工作台，在火焰旁将血液滴入2个盛有5ml培养液的培养瓶内，每瓶0.3ml，加入100ulPHA,盖上橡皮塞，轻轻摇动以混匀。贴好标签，将培养瓶放在37℃恒温箱内静置培养72h。（每天摇动培养瓶一次）（三）秋水仙素处理:向经恒温培养68-72小时(细胞生长到繁殖期即可)的外周血淋巴细胞培养液中加入22ul秋水仙素，使其终浓度为0.6ug/ml,轻轻将液体摇匀，继续恒温培养3-6小时。（四）标本的制备:1、收集细胞：终止培养后，将培养物混匀，倒人离心管内，离心沉淀8分钟(1000r/min)，弃去上清液。2、低渗处理：先加入1ml0.075mol/l的kcl溶液，

7、轻轻吹打，使细胞重悬。然后补加6mlkcl溶液，37摄氏度低渗20分钟。3、预固定：低渗处理完毕后，直接加入新配的Carnoy固定液1m1进行预固定，混匀后，离心8分钟(1000r/min)，去除上清液。4、固定：沿离心管壁缓慢加入固定液6m1，轻轻吹打混匀，置室温20分钟，离心去除上清液。5、重复固定一次。6、尽量吸净上清液，视管底剩下的细胞多少加入适量固定液(0.3～0.6m1)，轻轻吹打成细胞悬液。7、滴片：沉淀物中加入0.2-0.5ml固定液，用吸管吹打使其成为细胞悬液，用镊子取预先冰冻的干净载