芽孢杆菌胞外多糖的结构初步分析

《芽孢杆菌胞外多糖的结构初步分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、芽孢杆菌胞外多糖的结构初步分析万红贵*第一作者:研究员(1955-)袁建锋单咸旸朱明新宗素艳石楠（南京工业大学制药与生命科学学院南京210009）摘要：从筛选自新疆罗布泊沙漠的一株芽孢杆菌的发酵滤液中分离得到胞外多糖EPSⅠ和EPSⅡ，其中EPSⅠ为主要成分，占总糖的89.5%,本文主要报道了EPSⅠ一级结构及部分理化性质。EPSⅠ为糖蛋白，其分子量为96.292KDa，多糖含量为93.79%，蛋白含量为5.62%，不含糖醛酸，是由D-N-乙酰葡萄糖胺，D-木糖和D-甘露糖构成，它们的摩尔比例是2.36:0.

2、98:1.75。EPSⅠ为β型吡喃糖，经高碘酸氧化和Smith降解，EPSⅠ中含有(1→),(1→3)和(1→4)糖苷键，且(1→)和(1→4)糖苷键的比例为1:24.05,其中的糖肽是O-糖苷键。关键词：芽孢杆菌；糖蛋白；结构分析细菌多糖主要以三种形式存在：胞内多糖、胞壁多糖和胞外多糖。广义上的胞外多糖指的是糖被(glycocalyx)，包括微荚膜、荚膜、黏液层和菌胶团，对细菌本身来说它具有很多的功能。例如：保护细菌免受干旱损伤、免受宿主细胞的吞噬、储藏养料、堆积某些代谢和表面吸附作用等等；狭义上的胞外多糖

3、指的是黏液层，是一种扩散到培养基中的多糖，也是人们通常所说的胞外多糖[1]。细菌胞外多糖除了其对细菌自身的生物学意义之外，更重要的是由于它具有安全无毒、理化性质独特、用途广泛、易与菌体分离及可通过深层发酵实现工业化生产等优良性质而倍受关注[2]。近些年来，一些具有生物活性的细菌胞外多糖开始引起人们的重视，它们同一些真菌多糖和中草药多糖一样，对机体具有很强的免疫增强和抗肿瘤作用。因此，它们作为一种新型糖，成为科学工作者研究的一个新热点。本课题报道了细菌发酵粘液中分离得到多糖EPSⅠ的理化性质和一级结构，为以后的

4、进一步生物学功效的研究打下基础。1材料与方法1.1供试菌株芽孢杆菌Bacillus，筛选自新疆罗布泊沙漠。1.2仪器和试剂TGL-16G高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；Alltech高效液相色谱仪，426型HPLC泵，ELSD2000检测器，Alltech色谱工作站，（美国奥泰科技有限公司）；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；数显恒温水浴锅HH-4（国华电器有限公司）；PHS-3C精密pH计（上海精密科学仪器有限公司）；DZF-602型真

5、空干燥箱（上海博讯实业有限公司）；BS-100A自动部分收集器（上海沪西分析仪器厂）；Nicolet380FT-IR（美国热电公司Thermo）；TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；柱层析系统；BS124S电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）。活性炭；SephadexG-100（Wolsen）；标准葡聚糖(Dextran)（AR，国药集团化学试剂有限公司）；其余试剂除注明外都为分析纯。1.3培养基和培养条件培养基使用葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基。16h的种子以1%(V/V)

6、的接种量转接至发酵培养基，发酵摇瓶的装液量为50mL，于30℃，200r/min的条件培养48h。1.4胞外多糖EPSⅠ的制备发酵液经离心除去菌体，得到的上清液使用Sevag法除去杂蛋白，调节pH值为7.0，以1:4的体积比加如95%的乙醇，4℃过夜，10000r/min,10min离心收集沉淀，真空干燥得粗多糖。将粗多糖溶解后上活性炭柱（1.5×24cm），先用蒸馏水60mL洗脱，再用60%乙醇60mL洗脱，最后使用95%乙醇60mL洗脱，每150s收集一管洗脱液，硫酸-苯酚法跟踪多糖分布，同时用考马斯亮蓝

7、法跟踪蛋白质分布，收集主峰部分。经过真空浓缩，上SephadexG-100柱纯化，硫酸苯酚法监测，收集其主峰部分，使用95%乙醇沉淀，真空干燥得到多糖纯品。1.5多糖的理化性质及组成分析1.5.1EPSⅠ的分子量测定：采用凝胶过滤色谱法测定[3]。1.5.2多糖的组成分析：1.5.2.1多糖含量测定：采用硫酸-苯酚法[4]，以葡萄糖作标准曲线，490nm检测波长。同样的操作，取1mL的样品液，测定490nm吸收值，由标准曲线计算多糖含量。1.5.2.2蛋白质含量测定：采用考马斯亮蓝法[5]，以牛血清蛋白作标准

8、曲线，检测波长595nm。1.5.2.3多糖中糖链-肽链的连接方式的确定（β-消除反应）[4]：称4mg样品，溶解于3mL蒸馏水中，加入3mL的0.4mol/LNaOH，于25℃下反应，在开始和反应后的1.5h，分别进行紫外测定，根据碱处理后的多糖在240nm处光吸收值的变化，即是否出现羟基不饱和氨基酸的特征吸收，来判断多糖中糖与蛋白质的结合的连结方式。1.5.2.4单糖组成分析：称取3mg样品，按