青霉素效价的生物测定

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1、青霉素效价的生物测定目的1.了解用杯碟法测定抗生素效价的原理。2.掌握青霉素效价生物测定的具体操作步骤与方法。3.掌握PH对分配系数的影响。概述抗生素的抗菌特性决定了它的医疗价值，因此，利用他们各自的抗菌活性来测定其效价有着重要的意义。效价的测定法有：液体稀释法、比浊法和扩散法等。本实验采用国际上最常用的杯碟扩散法来测定青霉素的效价。测定时，将规格完全一致的不锈钢小管（即牛津小杯）置于含敏感菌的琼脂平板上，并在牛津小杯中加入已知浓度的标准青霉素溶液和未知浓度的青霉素发酵液。于是，抗生素就自牛津小杯处向平板四周扩散，在抑菌浓度所达范围内敏感菌的生长被抑制而出现抑菌

2、圈。在一定的范围内，抗生素浓度的对数值与抑菌圈直径呈线性关系。因此，只要将被测样品与标准样品的抑菌圈直径进行比较，就可在标准曲线上查得未知样品的抗生素效价值，为科学实验或临床应用提供参考依据。材料和器皿⑴菌种：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus），产黄青霉（Penicilliumchrysogenum）。⑵培养基：生物检定培养基II胨6g酵母浸出粉6g葡萄糖1g牛肉浸出粉1.5g琼脂15~20g水1000ml除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节PH使比最终的PH值略高0.2~0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节PH值使灭菌后为6

3、.5~6.6，分装，灭菌。生物检定培养基Ⅲ胨5g氯化钠3.5g葡萄糖1g牛肉浸出粉1.5g磷酸氢二钾3.68g水1000ml酵母浸出粉3g磷酸二氢钾1.32g除葡萄糖外，混合上述成分，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节PH值使灭菌后为7.0~7.2，分装，灭菌。⑶试剂①pH6磷酸缓冲液：K2HPO42g(或K2HPO4·3H2O2.53g)，KH2PO48g，蒸馏水1000ml。取200ml加醋酸丁酯40ml，4度保存。②0.85%NaCl生理盐水溶液。③苄青霉素钠盐：1.667U/mg（1U即1国际单位，等于0.6ug）。①磷酸盐缓冲液（PH2.0）：

4、甲液：取磷酸16.6ml，加水至1000ml，摇匀。乙液：取Na2HPO4•12H2O71.63g，加水使溶液成1000ml。取上述甲液72.5ml与乙液27.5ml混合摇匀。加醋酸丁酯15ml，4度保存。②Na2HPO4-柠檬酸缓冲液：表Na2HPO4-柠檬酸缓冲液pH0.2mol/LNa2HPO4(mL)0.1mol/L柠檬酸(mL)2.610.989.13.224.775.33.835.564.54.444.155.9Na2HPO4分子量＝141.98；0.2mol/L溶液为28.40g/L。Na2HPO4·2H2O分子量＝178.05；0.2mol/L溶

5、液为35.61g/L。Na2HPO4·12H2O分子量＝358.22；0.2mol/L溶液为71.63g/L。柠檬酸C6H8O7·H2O分子量＝210.14；0.1mol/L溶液为21.01g/L。加醋酸丁酯15ml，4度保存。⑷其他：牛津小杯[不锈钢小管，内径（6+0.1）mm，外径（8+0.1）mm，高（10+0.1）mm]，培养皿（直径90mm，深20mm；大小一致，皿底平坦），试管、滴管、移液管（5、1ml）及大口10ml移液管等。方法和步骤1敏感菌悬液的制备⑴保藏与传代：将测定用的金黄色葡萄球菌在新鲜斜面培养基II上传代并保存。注意测定用敏感菌应每隔3

6、周传代一次，菌种可在37℃温箱培养18～20h后，再在室温下置放3～4h，使菌种斜面产生良好的色素，然后将其置于4℃冰箱保存。⑵活化：在使用前先将供试菌株在斜面培养基II上连续传代3～4次，使菌种充分恢复其生理性状。⑶制备悬液：将活化的敏感菌斜面，用0.85%生理盐水洗下，经离心后去除上清液，再用生理盐水洗涤1~2次，并将其稀释至一定浓度的悬液。2青霉素标准溶液的配制（1）青霉素标准母液：准确称取纯青霉素G钠盐15~20mg,，溶液在一定量的pH6磷酸缓冲液中，使成2000U/ml的青霉素溶液，然后保持冷藏存放。（2）青霉素标准工作液：使用时以标准母液配成10U

7、/ml青霉素标准测定液，按表1加入青霉素标准母液，即配成不同浓度的青霉素标准液。表不同浓度标准青霉素液的配法试管编号10U/ml工作液量/mlPH6磷酸盐缓冲液/ml青霉素含量/(U·ml-1)1234560.40.60.81.01.21.49.69.49.29.08.88.60.40.60.81.01.21.43标准曲线的绘制（1）倒底层培养基：取无菌培养皿10套，每皿移入15ml培养基II，置水平待凝备用。（2）铺含菌上层培养基：将装在三角瓶中的培养基II（100ml）融化，待冷却到50℃左右时加入金黄色葡萄球菌菌液3～5ml（加入菌液的浓度应控制在使1U/

8、ml青霉素溶液的抑制菌圈