Western_Blotting免疫印迹(试剂配制--每步操作详解--WB常见问题分析报告--分离范围).doc

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1、Western（试剂配制和操作步骤）试剂配制：（一）母液  （二）使用液 操作步骤：（一） 蛋白样品制备 （二） 蛋白含量的测定 （三） SDS－PAGE电泳 （四）转膜 （五）免疫反应 （六）化学发光，显影，定影 （七） 凝胶图象分析关键词：印迹试剂Western印迹法免疫反应蛋白样品制备SDS－PAGE电泳这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。Western使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。这种技

2、术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。耗材：硝酸纤维素膜，乳胶手套，保鲜膜，搪瓷盘（>20×20cm），X-光片夹，X-光片，玻棒长短各一根，计时器，吸水纸，试剂配制：（一）母液1.0mol/LTris•HCl           Tris(MW121.14)         30.29g            蒸馏水                200ml  溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。       

3、            PH          HCl                   7.4        约17ml                   7.5        约16m                   7.6        约15ml                   8.0       约10ml10％SDS            SDS                 10g          蒸馏水至              100ml50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期

4、保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。10％过硫酸胺（AP）                 过硫酸胺            0.1g                 超纯水              1.0ml溶解后，4℃保存，保存时间为1周。1.5mol/LTris•HCl（pH8.8）                 Tris(MW121.14)        45.43g                  超纯水                        200ml溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，

5、最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。0.5mol/LTris•HCl（pH6.8）                   Tris(MW121.14)        15.14g                  超纯水                         200ml溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。20％Tween20Tween20         20ml蒸馏水至        100ml混匀后4℃保存。（二）使用液单去污剂裂解液

6、（50mmol/LTris•HClpH8.0，150mmol/LNaCl，1％TritonX－100，100?g/mlPMSF）：1mol/LTris•HCl（pH8.0） 2.5mlNaCl                                      0.438gTritonX－100                     0.5ml蒸馏水至                              50ml                 混匀后，4℃保存。使用时，加入PMSF至终浓度为1

7、00?g/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/mlPMSF50μl）。0.01mol/LPBS（pH7.2-7.4）NaCl                                8.0gKCl0.2gNa2HPO4 1.44g(Na2HPO4 .H2O1.56gNa2HPO4 .12H2O3.58g)KH2PO40.2g蒸馏水至                        1000mlG250考马斯亮蓝溶液（测蛋白含量专用）                 考马斯亮蓝G250： 100mg

8、                 95％乙醇：        50ml                 磷酸：            100ml                 蒸馏水至          1000ml配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存。0.15mol/LNaClNaCl（MW58.44）  0.877g蒸馏水至         100m