淋巴细胞分离实验分析课件.ppt

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1、免疫学实验一外周血单个核细胞的分离外周血单个核细胞的分离原理试剂和仪器实验步骤注意事项原理外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。原理外周血红细胞粒细胞单个核细胞血小板淋巴细胞单核细胞1.0931.030~1.0351.075~1.090Ficoll：1.077±0.001(PBMC)1.0921500rpm,20℃,30minPBMC红细胞粒细胞Ficoll稀释外周血Ficoll稀释的血浆、血小板实

2、验步骤1.采血，稀释（外周血：稀释液=1：2）2.在离心管中加入Ficoll，沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周血（Ficoll：稀释血=1：2）实验步骤3.20℃，1500r/min，离心30min4.沿管壁周缘轻轻吸取PBMC层移入另一试管中实验步骤5.加足量稀释液充分洗涤，1800r/min离心10min，弃上清6.重复洗涤一次，1400r/min离心10min，弃上清7.适量的培养基重悬细胞，计数试剂和仪器淋巴细胞分层液（Ficoll，低温避光保存），Hanks液，RPMI1640，PBS，小牛血清，

3、华氏管，50ml离心管，2ml（5ml）吸管，水平离心机注意事项1.每毫升外周血液大约可获1×106单个核细胞2.Ficoll应适量，外周血应充分稀释2.温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果3.在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢加，以免冲散界面4.吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染细胞计数试剂和仪器实验步骤注意事项试剂和仪器血球计数板，盖玻片，Hanks液，RPMI1640，2ml（5ml）吸管，华氏管，移液尖，微量移液器，显微镜实验步骤1、准备计数板：2、制备

4、细胞悬液：收集细胞，制成单个细胞悬液3、加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液，4、计数：在显微镜下，用10×物镜观察计数板四角大方格中的细胞数实验步骤5、计算：将结果代入下式，得出细胞密度细胞数/毫升原液=（4大格细胞数之和/4）×104注意事项1.取样计数前，应充分混匀细胞悬液2.加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡3.细胞压中线时，数上不数下，数左不数右4.本法要求细胞密度不低于104细胞/ml5.镜下计数时，细胞数过少或过多，说明稀释不当，需重新制备

5、细胞悬液、计数实验要求华氏管中加入血样后，用记号笔作好标记实验完毕后，请清洗试管、吸管和计数板试验报告要求试验内容(原理、步骤),结果试验注意事项