温莪术内生真菌的分离及其分类鉴定

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1、温莪术内生真菌的分离及其分类鉴定【关键词】内生真菌；分离；鉴定；温莪术　IsolationandIdentificationofEndophyticFungifromCurcumaaromaticaSalisb　　Abstract：ObjectiveToisolateandidentifytheendophyticfungiofdifferentpositionsinCurcumaaromaticaSalisb.MethodsEndophyticfungihealthyroots,stemsandleavesofCurcumaaromaticalSalisban

2、didentifiedethod.ResultsNinty-ninestrainsofendophyticfungibelongto21genusorhpologicallyidentifiedfromCurcumaaromaticaSalisb.Forty-ts,and45strainsof12generainleaves.ConclusionThequantity,populationanddistributionoftheendophyticfungiarevariousindifferentpositionofCurcumaaromaticaSalisb

3、.　　KeyaaromaticaSalisb　　植物内生真菌(EndophyticFungi)是存在于健康植物组织、器官内，并不引起明显病害症状的一类真菌［1］。植物与真菌的共生现象在生物进化过程中历史悠久而又极其普遍。虽然人们很早就知道内生真菌的存在，但直到1977年才对其重要性有所认识［2］。通过二十多年的研究，人们发现，作为地球上一类古老而又普遍的共生生物，植物内生真菌不仅可以提供人类丰富的药用性次生代谢产物［3］，而且有可能从整体上参与和协调植物与环境因子(包括病原微生物)的互作过程，从而对植物的抗逆性和环境适应性产生积极的影响［4］。　　温莪术为姜科植

4、物温郁金Curcumal)和gSO4·7H2O0.5g，FeSO40.01g，K2HPO41g，琼脂15～20g，水1000ml）。　　2方法　　2.1内生真菌的分离取温莪术的根、茎、叶，用刀切成2～3cm的小块，按下列步骤进行表面消毒：自来水冲洗干净，75%的酒精漂洗1～2min，无菌水冲洗3min，0.1%的升汞漂洗10～20s，无菌水冲洗4～5次。上述处理过的样品，在无菌状态下切割成约0.5cm×0.5cm的小块(片),分别置于已倒好的WA—抗生素平板培养基和PDA平板培养基上，放置在28℃条件下。　　2.2内生真菌的纯化接种物培养3～7d后，观察皿中材料

5、切口处长出菌丝(菌落)，挑取切口处菌丝尖端转接到新的PDA平板上，待长成菌落后，根据菌落形态、颜色的差异及长出时间的不同，分别挑取其边缘的菌丝进行分离培养，观察菌落的形态及其菌落边缘的整齐情况，并做相应记录。采用菌丝顶端纯化法如此反复纯化后，转入PDA斜面培养基上，于28℃培养箱中培养5～7d后，对菌株进行编号，并放入4℃冰箱保存。　　2.3菌种的鉴定采用直接挑取制片法和插片培养法，观测菌种在培养过程中菌丝、个体发育、产孢结构和孢子形态等特征，对分离得到的内生真菌进行显微形态观察、分类鉴定［8～11］。　　3结果　　3.1分离方法的比较本实验过程中尝试了组织研磨

6、涂平板和组织切片分离两种方法。结果表明研磨法的优点是能获得较多菌株，但表面消毒验证效果不佳，且菌株不易纯化；而组织切片培养的方法操作简单，表面消毒验证效果可靠，菌株易纯化。为此本研究最终选择了表面消毒后组织分离培养的方法。　　3.3温莪术内生真菌的种群组成从温莪术不同组织中分离得到的99株内生真菌，经显微形态观察，初步鉴定为5目、6科、21属，另外，还有9株不产孢，为无孢菌群（见表2）。表2温莪术内生真菌的种群组成（略）　　由表2可知，温莪术内生真菌以镰孢霉属为优势种群，约占总数的13%；其次为曲霉属和青霉属，约占总数的10%；此外，无孢菌群在其内生真菌中也占有

7、较大的比例。从表中可见温莪术内生真菌最明显的特征是在种类组成上具有多样性。　　4讨论　　在内生菌的分离过程中，进行表面消毒时,0.1%升汞的漂洗时间不能长,尤其是对于幼嫩的叶片消毒时间要比根茎更短,否则分离到的菌落少,甚至会把内生菌全部杀死。　　所分离的真菌在查氏培养基上一般生长较缓慢,在马铃薯葡萄糖培养基(PDA)上生长较快,许多真菌在PDA上有色素产生,而在查氏培养基上无色素产生。PDA营养比较齐全,所以培养效果好,生长快,这主要是营养条件决定的,因此，我们培养真菌一般用营养条件好的PDA,而在鉴定时一般用查氏培养基,因查氏培养基成分清楚,干扰小,在其上生长

8、时真菌的各种鉴定的特性更