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1、含有非甲基化CpG的双歧杆菌DNA对小鼠骨髓树突状细胞成熟的影响论文安蔚，赵苗青，李雅林，李松，康莉，宋文刚【关键词】甲基化StimulatoryeffectofbifidobacteriaDNAcontainingunmethylatedCpGmotifsonmaturationofbonemarroethylatedCpGmotifs(CpGDNA)onthematurationofbonemarroicDNAofbifidobacteriaethylateddegreeofCpGmotifsetry.ThelevelsofIL6,
2、IL12(p40)andTNFαolecules,significantlyincreasedthesecretionofIL6,IL12(p40)andTNFαandsignificantlyenhancedtheproliferationofallogenicandhomogenicTcells.CONCLUSION:BifidobacteriaDNAhasremarkablestimulatoryeffectsonBMDCmaturationandantigenpresentingfunction.【Keyice【摘要】目的：探讨
3、双歧杆菌DNA对小鼠骨髓树突状细胞(BMDC)成熟的影响.方法：纯化提取双歧杆菌DNA，并鉴定DNA制品CpG基序甲基化程度；FACS检测BMDC的吞噬功能和表面标志分子，ELISA法检测BMDC分泌细胞因子水平.freelarroega公司，LPS,小牛胸腺DNA(CalfthymusDNA,CTDNA),DextranFITC购自Sigma公司，溶菌酶、限制性内切酶HpaⅡ购自中国医学科学院友谊公司，小鼠IL6,IL12(p40),TNFαELISA检测试剂盒购自R＆D公司，RPMI1640完全培养基RPMI1640（Hyclone
4、公司）,100mL/L胎牛血清（Hyclone公司）组成，4℃保存备用；3HTdR购自Amersham公司，抗小鼠CD4(Gk1.5),CD8（2.43）,B220（RA3.3A1/6.1）,Iab(B212)单克隆抗体杂交瘤细胞株均购自ATCC，不同荧光素标记的大鼠抗小鼠单抗CD11cPE,CD40FITC,CD86PE,IabFITC及FITC或PE标记的同型对照抗体均购自PharMingen公司，4℃保存.C57BL/6（H2Kb）小鼠60只，Balb/c（H2Kd）小鼠24只，6～8/A280nm为1.823，测定DNA浓度后经
5、薄板层析证实所制备的BDNA中无LPS存在.BDNA与HpaⅡ酶作用后电泳结果显示，细菌DNA可被顺利切割成小片段，表明所制备的BDNA具有一定的非甲基化CpG基序，冷冻干燥后备用.1.2.2小鼠BMDC的培养扩增［5］颈椎脱位法处死C57BL/c小鼠，无菌取股骨，冲洗出骨髓细胞，加TrisNH4Cl裂解液室温作用3min，溶除红细胞，Hanks液洗2次，加入大鼠抗CD4,CD8,Iab,B220单抗混合液，抗体终浓度均为10mg/L,4℃孵育45min,Hanks液洗1次，加入含20g/LBSA的RPMI1640培养基及Hepes25
6、mmol/L沉悬细胞，再加入兔低毒性补体（10∶1稀释），37℃水浴45min溶除T,B及Ia+细胞，Hanks洗2次，以1×106细胞/孔加入24孔板培养，加mGMCSF10μg/L,mIL41μg/L，培养3d后，吸弃培养基及悬浮细胞，重新加入含有mGMCSF,mIL4的新鲜RPMI1640完全培养基，继续培养2d后，吹打下疏松贴壁的增殖性细胞聚集体，收集后BMDC以1×106细胞/孔加入24孔板培养，分别加入BDNA(10mg/L),LPS(1mg/L),CTDNA(10mg/L),PBS置37℃,50mL/LCO2培养24h后，
7、收集BMDC和培养上清待测.1.2.3流式细胞仪检测BMDC表面标志和内吞能力收集培养各处理组BMDC，用PBS悬浮为1×109细胞/L，加入离心管，100μL/管，分别加入荧光标记抗体Ia,CD40,CD86,CD11c，终浓度为5mg/L，置4℃标记45min，PBS洗2遍，以荧光标记的同型Ig作为对照；用流式细胞仪（FACScalibur，BD公司）CellQuest软件检测和分析BMDC表面标志.收集培养各处理组BMDC，铺24孔培养板（2.5×105细胞/孔/500μL）,然后加入预冷DextranFITC，终浓度为25mg/
8、L，置37℃,50mL/LCO2孵育30min，对照细胞加入DextranFITC后仍置于冰上孵育30min.预冷PBS洗细胞2次后，以流式细胞仪检测BMDC的荧光程度.FITC的绿色荧光的平均荧光强度（G
