柴胡皂甙d对小鼠骨髓来源树突状细胞成熟影响的研究

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1、中由大学硕士学位论文柴胡皂甙d对小鼠臀髓来源树突状细胞成熟影响的研究柴胡皂甙d对小鼠骨髓来源树突状细胞成熟影响的研究2005级科研型硕士研究生杨璞中由大学附属第二医院肾内科专业内科学(肾病)导师徐安平主任医师中文摘要树突状细胞(dendriticcell，DC)是已知功能最强的专职抗原提呈细胞．能刺激初始T细胞启动早期免疫应答，是免疫反应的枢纽。机体内骨髓来源DC的分化分瘁个阶段：前体期，未成熟期，迁移期，成熟期。骨髓DC前体进入血液循环变为未成熟DC，未成熟DC在外周摄取外源性抗原后迁移翔次级

2、淋巴器官，并在迁移过程中逐渐成熟。成熟DC通过其表面的主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)分子与共刺激分子递呈抗原给T细胞，从而激活免疫应答。DC是一类异质性细胞群体，具有不同的亚群和功能，因此它在调节机体免疫反应中的作用也不均一，既可以启动及调节先天性和获得性免疫应答，又能维持和诱导机体免疫耐受。研究显示DC的双重功能与其所处的不两发育阶段有着密切的关系，通过调控DC的发育状态可以调节免疫激活与免疫耐受闻的平衡，达到治疗免疫相关性疾病的目

3、的。研究认为T辅助细胞(helperTcell，Th)的分化主要由DC所控制。DC通过其表面分子刺激T细胞活化，通过细胞因子调节Th细胞分化方向．已有大量实验证实在leA肾病、抗中性粒细胞胞浆抗体(antineutrophilcytoplasmicantibodies，ANCA)相关性肾炎、狼疮肾炎等自身免疫性疾瘸中，DC起着重要作用。嚣前将DC作为自身免疫性疾病治疗的靶点已经取得了一定的成绩。一l一中山大学硕士学位论文柴胡皂甙d对小鼠骨髓来源树突状细胞成熟影响的研究中药是我国医学资源的一大宝库

4、，研究表明中药在机体免疫调节方面具有较大的优点，有研究证实一些复合成分的中药有较强的抑制淋巴细胞趋化反应和细胞因子产生的作用，并且其中一些中药的活性成分已经被分离出来，且有实验证实其活性成分对DC的功能有较强的抑制作用。阐明中药的作用机制，筛选有效药物，必将使中医药治疗自身免疫性疾病的研究达到更高水平。柴胡为常用中药，柴胡皂甙d(saikosaponin．d，SSd)是从柴胡中提取的主要活性成分，有糖皮质激素(glucocorticoid，GC)样甾环结构，国内外很多研究表明其具有抗炎、免疫调节

5、作用，因此观察SSd对DC成熟的影响和探索其作用机理，具有重要的临床意义。研究目的本实验首先建立体外扩增高纯度小鼠骨髓来源DC的体系，应用从中药柴胡中提取的活性成分SSd来干预DC，观察细胞形态、表面标识性抗原、分泌细胞因子及刺激异种T细胞增殖能力等的改变，探讨SSd影响树突状细胞的作用机制，为SSd治疗自身免疫性疾病提供实验和理论依据。材料和方法分离C57／BL6J小鼠骨髓细胞，采用重组小鼠粒细胞．巨噬细胞集落刺激因子和重组小鼠白细胞介素4诱导的方法，同时利用磁珠分选法纯化，通过脂多糖刺激DC

6、成熟。实验分8组，1组阴性对照组：未成熟DC；2组阳性对照组：成熟DC；3组SmDC：成熟DC予3个剂量SSd干预，在收集细胞前24h加SSd(2mg／ml、5mg／ml、10mg／m1)；4组SiDC：未成熟DC3个剂量SSd干预组。光镜观察DC细胞生长状况，电镜观察不同组别DC的形态改变，流式细胞仪检测不同组别DC细胞表面标志(MHCII、CD80、CD86)，混合淋巴反应(MLR)检测DC刺激T细胞能力，ELISA检测不同细胞因子分泌的改变。中山大学硪士学位论文柴胡皂甙d对小鼠骨髓来源树突

7、状细脆成熟影响的研究结果随着培养时闻延长，细胞集落明显增多，戮第5．7天，可见大量细胞悬浮。与未成熟DC组相比，加入脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)可以明显刺激DC的成熟，表面突起增多，MHCll、CD80、CD86升高。磁珠分选后DC表达CDlte臻显增高，培养细胞达到实验要求。对于成熟DC，加SSd干预熊明显抑制DC表谣MHCII类分子及欺刺激分子(C转8e，eD86)表达，抑制善细胞增殖，分泌IL-12减少，裁激T细胞分泌IL．10增多、分泌lL艺降低。绷胞表面突起减

8、少，囊泡结构增多，形态近似未成熟DC。对于未成熟DC，给予SSd，并没有明显作用，其各项指标与imDC组没有统计学差异。结论，’H，‘．Jl。SSd对小鼠臀髓来源DC有抑制成熟的侔耀：(1)SSd抑制焉DC形态近似未成熟DC：树突较少，囊泡结构明显；0)降低细胞表面MHCII、CD80、CD86水平；(3)增鸯嚣DC刺激T缁胞的糍力；似)抑剑DC分泌lL．12；(5)降低DC刺激T细胞分泌IL一2，增加T细胞分泌lL。lO。2．SSd对C57／BL6J小鼠骨髓来源未成熟DC作阉不明显。关键调：柴