慢病毒介导的稳定表达GSTM5的人支气管上皮细胞株的建立及其核转位分析

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1、慢病毒介导的稳定表达GSTM5的人支气管上皮细胞株的建立及其核转位分析【摘要】目的构建稳定表达GSTM5的人支气管上皮16hbe细胞株，探讨谷胱甘肽S转移酶mu5（GSTM5）核转位的关键因素。方法构建表达GSTM5基因的重组慢病毒载体并制备出相应的慢病毒，感染人支气管上皮16hbe细胞后，经嘌呤霉素筛选获得细胞克隆；实时荧光定量PCR和蛋白印迹法（Western-Blot）分别检测细胞株中GSTM5的mRNA、蛋白表达水平；以TNF-α（10ng/mL）刺激稳转株1小时，共聚焦荧光显微镜检测GSTM5核转位。结果：成功构建了重组慢

2、病毒表达质粒PLVX-puro-GSTM5-SBP-3*flag-N、PLVX-puro-3*flag-SBP-GSTM5-C并包装慢病毒，感染16hbe细胞后经嘌呤霉素筛选得到16hbe-GSTM5-SBP-3flag-N、16hbe-SBP-3flag-GSTM5-C细胞株；稳转株GSTM5基因的mRNA和蛋白表达显著上调；GSTM5在TNF-α刺激后存在核转位，16hbe-GSTM5-SBP-3*flag-N稳转株核内GSTM5的量较另一个稳转株更大。结论：构建的细胞株能稳定表达GSTM5基因，TNF-α诱导GSTM5核转位与

3、其N端含有非经典核定位信号密切相关。【关键词】谷胱甘肽S转移酶mu5；重组慢病毒表达质粒；16hbe；核转位前言急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是一个具有复杂病理和发病机制的危重症临床综合征，其本质是肺部过度失控的炎症反应[1]。过度炎症反应引发氧化应激状态，诱导细胞内源性活性氧（ROS）的生成量剧增，超过机体抗氧化系统的清除能力，使机体处于进行性加重的氧化应激状态，导致肺结构细胞损伤[2]。谷胱甘肽S转移酶（glutathione-S-transferase，GST）与谷胱甘肽结合，是具有多种功能的催化氧化还原反应的酶超家族，与其他

4、抗氧化酶在细胞内共同起到清除活性氧，保护细胞免受氧化损伤的作用[3]。谷胱甘肽S转移酶mu5（GSTM5）是GST家族的成员。本研究小组前期对炎症诱发的氧化应激调控的研究发现，TNF-α刺激16hbe细胞后NOX1转录及表达明显上调[8]，GSTM5与NOX1启动子间存在着相互作用[4]，这引起了我们对GSTM5的关注。本研究拟构建人GSTM5基因的慢病毒表达载体及稳定表达GSTM5的人支气管细胞系，并观察TNFα刺激模拟的细胞炎症状态下GSTM5核转位情况，为后续研究GSTM5的转录调控功能奠定基础。材料与方法一、材料16HBE、

5、293T细胞、Stbl3菌种由广州军区总医院医学实验科细胞库提供；北美胎牛血清、DMEM高糖培养基、胰酶、谷氨酰胺（Gln）购于gibico公司；重组人TNF-α购自美国PeproTech公司；BCA法蛋白浓度测定试剂盒、逆转录试剂、PCR、Real-timePCR相关试剂购自TaKaRa公司；引物由上海英潍捷基公司合成。慢病毒系统（含表达载体plvx-puro-kozak-3*Flag-SBPTag2、plvx-puro-MCS-SBPtag2-3*flag和2种包装质粒psPAX2、Pmd2.G)、慢病毒包装专用促转染试剂FIt

6、ran购于辉骏生物；限制性内切酶、T4DNA连接酶购自ThermoScientific公司；ClonExpressIIOneStepCloningKit连接酶购自诺唯赞公司；质粒提取和凝胶回收试剂盒为Qiagen公司产品。Trizol试剂、转染试剂Lipofectamine2000和嘌呤霉素购自Invitrogen公司；ECL荧光底物试剂盒购自美国Pierce公司。抗flag荧光抗体（ab106221）、抗GSTM5抗体（ab112918）购自abcam。二、方法1.重组慢病毒表达质粒PLVX-puro-GSTM5-SBP-3*fl

7、ag-N、pLVX-Puro-kozak-3*flag-SBP-GSTM5-C及慢病毒制备：根据GSTM5（NM_000851）基因序列设计引物（序列见表1），使用PrimeSTAR高保真酶扩增基因目的片段。使用微量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收pcr产物。2个载体与Gstm5-F2、R2的pcr产物进行双酶切。琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，切割在琼脂糖凝胶电泳胶中的目的基因片段条带和酶切后的载体载体条带，回收纯化，用T4DNA连接酶连接载体和目的基因片段，以得到重组慢病毒载体PLVX-puro-GSTM5-SBP-3*flag-N。

8、使用ClonExpressIIOneStepCloningKit无缝连接GSTM5-F/R的pcr产物及PLVX-puro-3*flag-SBP-C，以得到pLVX-Puro-kozak-3*flag-SBP-GSTM5-C。将10µ