慢病毒介导HLA-G转基因小鼠的建立

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1、慢病毒介导HLA-G转基因小鼠的建立王露露，刘勤，周晓杨，刘昌峨，王勇，魏泓（400038重庆，第三军医大学基础医学部实验动物学教研室）[摘要]目的以慢病毒作为载体建立HLA-G转基因小鼠，为研究HLA-G与移植免疫提供模型动物。方法利用FUW载体，构建含有HLA-G编码序列的慢病毒表达载体FUW-HLA-G。用磷酸钙沉淀法将包装质粒psPAX2、PMD2.G与重组慢病毒载体质粒FUW-HLA-G共转染293FT细胞，包装成慢病毒。通过同步转染含有绿色荧光标记基因的慢病毒质粒FUGW为参照，测定FUW-HLA-G病毒液的滴度。用显微注射法将浓缩后的病毒液注射至FVB/N小鼠1-细胞期胚胎

2、透明带下，建立HLA-G转基因小鼠。PCR鉴定转基因小鼠的基因整合，用RT-PCR检测转基因在转录水平的表达，用Westernblot检测HLA-G蛋白的表达。结果载体BamHI、EcoRI双酶切结果和测序结果显示重组的慢病毒质粒与所设计的序列一致。浓缩和纯化后的病毒液滴度达到109TU/ml以上，符合用慢病毒制备转基因小鼠的要求。PCR筛选出阳性鼠6只，RT-PCR与Westernblot检测结果表明HLA-G基因在F0和F1代转基因小鼠中均有表达。结论本实验通过慢病毒介导的基因转移，成功建立了表达人HLA-G蛋白的转基因小鼠，为研究HLA-G的功能及其在器官或组织移植中的效应提供了动

3、物模型。[关键词]HLA-G；慢病毒；转基因小鼠[中图法分类号]R-332；R373；R392.4[文献标志码]AGenerationofHLA-GtransgeniemicebylentiviraltransgenesisWangLu1u,LiuQin,ZhouXiaoyang,LiuChang’e,WangYong,WeiHong(DepartmentofLaboratoryAnimalScience,CollegeofMedicine,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing,400038,China)[Abstract]0bjectiveT

4、oestablishHLA-Gtransgeniemicebylentiviraltransgenesis,andtherebytoprovideananimalmodeltoinvestigatetheHLA-G’simpactsontissueororgantransplantation.MethodsThetransgenevectorwasconstructedbyinsertingtheHLA-GencodingfragmentintoalentiviralvectorFUW.Theresultedrecombinantlentiviralvector,FUW-HLA-G,wa

5、spackagedintolentiviralparticlesbyco-transfectingtherecombinantlentiviralvectorinto293FTcellsalongwithtwopackagingvectors,psPAX2andpMD2.G.Theviralsuspensionwasconcentratedby“two-step”high-speedcentrifugation.ForaccuratetitrationofFUW-HLA-Glentiviralparticles,anotherlentiviralvectorcontainingamark

6、ergeneeGFPwaspackagedandconcentratedinparallel.Transgenicmiceweregeneratedbyinjectingtheconcentratedviralsuspensionintoperivitellinespaceofmicemurine1-celleggs.ThetransgenicfoundermicewerescreenedbyPCRandtransgeneexpressionwasdetectedbyRT-PCRandWesternblot.ResultsDoublerestrictivedigestionandsequ

7、encingconfirmedthattherecombinantlentiviralvectorFUW-HLA-Gwascorrectlyconstructed.ThebiologicaltitresoftheFUW-HLA-Gvirusconcentratesweredetectedtobenolessthan1×109TU/ml,whichwassufficientforlentiviraltransgenesisinmamm