同型半胱氨酸对ecv304细胞nfκb活性的影响及金雀异黄酮的保护机制

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1、同型半胱氨酸对ECV304细胞NFκB活性的影响及金雀异黄酮的保护机制【摘要】　　目的检测同型半胱氨酸(HCY)对人脐静脉内皮细胞株ECV304的损伤对细胞核因子(NFκB)活化的影响及金雀异黄酮（GEN)的保护作用。方法以5.0mmol/L的HCY作用于ECV304细胞：设不同浓度的GEN（10、50、100μmol/L）保护组孵育12h后，再加入5.0mmol/L的HCY，通过四噻氮唑盐（MTT）比色法观察细胞活性，通过Western印迹法、免疫组化观察NFκB表达情况。结果HCY可降低ECV304细胞的细胞活力，NFκB表达增强；而在加

2、入不同浓度的GEN预处理后，细胞活性显著增高，NFκB表达水平显著下降，且呈现剂量依赖性（r=-0.95，P<0.05）。结论HCY可作用于ECV304细胞，活力下降，上调NFκB蛋白及其靶基因的表达，而GEN能逆转HCY所引起的NFκB活性增高的作用。【关键词】金雀异黄酮（GEN）；同型半胱氨酸（HCY）；人脐静脉内皮细胞；NFκB【Abstract】ObjectiveTostudytheeffectofhomocysteine(HCY)onactivationofNFκBinECV304andexploretheprotectiono

3、fGenistein(GEN).MethodsMTTassaywasusedtodetectcellviability,andtheexpressionofNFκBwasobservedbyWesternblotandimmunohistochemistry.ResultsThe10cellularviabilityof5.0mmol/LHCY〔(41.27±5.09)%〕waslowerthanthoseoftheothergroups,andtheexpressionofNFκBincreasedtoo.Aftercotreatmentof5.0m

4、mol/LHCYanddifferentconcentrationGEN（10,50,100μmol/L）,thecellularviabilityofeachgrouphadelevatedandtheexpressionofNFκBdecreased.ConclusionsHCYcanleadtoendothelialdysfunctioninECV304byincreasingtheactivityofNFκB.GENcanprotectthecellviabilityanddecreasetheexpressionofNFκB.【Keywor

5、ds】Genistein；Homocysteine；ECV304cells；NFκB　　动脉粥样硬化(AS）是一类严重危害人类健康的心血管疾病，其发生发展与多种因素有关。同型半胱氨酸(HCY)属含硫氨基酸，体内不能合成，能够引起内皮细胞功能紊乱〔1〕。大量实验证明，HCY是导致AS的独立的危险因素。金雀异黄酮(GEN)，可以改善血管内皮功能〔2〕,可以抑制HCY诱导的炎症损伤,抑制内皮细胞与白细胞/血小板等黏附〔3〕,具有防止早期AS等多种药理作用及生物活性。本研究通过观察HCY对ECV304血管内皮细胞刺激的细胞核因子NFκB的影响，同时观察GEN

6、的保护作用，旨在探讨HCY致AS的机制以及GEN的保护作用，为其应用于临床治疗AS提供科学的理论依据。10　　1材料与方法　　1.1主要试剂　　人脐静脉内皮细胞株ECV304（武汉大学中国生物典藏中心）；HCY、GEN、DMSO均购于Sigma公司；四甲基噻唑氮蓝(MTT)购于Fluka公司；鼠抗人NFκBp65抗体、羊抗鼠IgG、βactin抗体购于SantaCruz公司。　　1.2方法　　1.2.1ECV304细胞培养　　人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞接种于含10%灭活小牛血清的新鲜RPMI1640培养液中，置37℃、5%CO2培养箱中。所

7、有实验操作均采用对数生长期的细胞。　　1.2.2实验处理　　HCY用无血清1640培养液混匀，GEN用DMSO溶解，实验分为5组，正常对照组；HCY5.0mmol/L组；GEN10μmol/L+HCY5.010mmol/L组；GEN50μmol/L+HCY5.0mmol/L组；GEN100μmol/L+HCY5.0mmol/L组。对照组加不含任何药物的培养液100μl，每组设4个复孔。　　1.2.3MTT法检测细胞生长情况　　参照Tada测定细胞活性的改良法〔4〕，消化细胞调整浓度至4×104ml-1，接种于96孔培养板，每孔100μl，培养过夜，细胞贴壁生

8、长，80％融合时，吸弃原培养液。实验组预先加入终浓度