姜黄素抑制宫颈癌细胞株增殖和诱导凋亡的体外研究

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1、姜黄素抑制宫颈癌细胞株增殖和诱导凋亡的体外研究【摘要】目的：探讨中药姜黄素(Cur)对子宫颈癌SiHa细胞株的增殖抑制和诱导凋亡的作用。方法：以不同浓度的姜黄素(10umol/L、20umol/L、30umol/L)，分12h、24h、48h、72h4个时间点处理SiHa细胞,光镜观察细胞形态变化;用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞增殖抑制率;用透射电子显微镜及琼脂糖凝胶电泳检测凋亡的发生。结果：姜黄素可抑制SiHa细胞增殖，作用呈明显的时效和量效关系，差异有非常显著性(P<0.01);姜黄素可诱导SiHa细胞凋亡，透射电子显微镜下可见凋

2、亡细胞;琼脂糖凝胶电泳出现细胞凋亡典型的DNA“梯状”条带。结论：姜黄素体外对SiHa细胞具有增殖抑制作用和促进凋亡作用。【关键词】姜黄素;SiHa细胞;凋亡;琼脂糖凝胶电泳子宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤,近年发病率又有上升和年轻化趋势。目前治疗宫颈癌仍以手术为主,但根治术的5年生存率较低,子宫颈癌对放疗的敏感性也具有个体差异,且放疗后易出现局部转移和复发。因此寻找有效的子宫颈癌化疗药物具有重要意义。本文研究了中药姜黄素对人宫颈癌SiHa细胞株的增殖和凋亡的影响,为寻找新的有效治疗子宫颈癌的药物提供理论依据。9　　姜黄素是从姜科植物中提取的一种食物

3、色素，具有多方面的药理作用，如抗炎、抗氧化、抗凝、降血脂及抗动脉粥样硬化等作用[1，2]。近来研究表明，姜黄素可抑制体内、外肿瘤的生长及诱导多种肿瘤细胞凋亡，已成为抗肿瘤研究热点[3，4]，但其对妇科肿瘤宫颈癌的作用报道较少。　　1材料和方法　　1.1材料　　人宫颈癌SiHa细胞株购自上海科学院细胞中心。药物:姜黄素购自美国Sigma公司、苯甲基磺酰氟(PMSF)、DNALadder试剂盒(美国Sigma公司);四甲基偶氮唑蓝(MTT)、胰蛋白酶、RMPI1640培养基、小牛血清(北京中山生物公司)。　　1.2细胞形态观察　　每瓶(25cm2)接

4、种1.5×105细胞,24h后加入不同浓度(10、20、30umol/L)的姜黄素处理,每天用倒置显微镜观察记录实验组和对照组的细胞形态变化。　　1.3MTT检测9　　以每孔1×105个SiHa细胞接种于96孔培养板,分为空白组(调零)、姜黄素实验组(10、20、30umol/L)和对照组(不加药物的细胞)，分别培养12h、24h、48h、72h后加入MTT液，再培养4h，吸弃孔中的培养上清,每孔加入150μlDMSO,混匀10min,在酶联免疫检测分析仪570nm处测定各孔吸光度值(A),抑制率(%)=(1-实验组平均A值/对照组平均A值)×1

5、00%。重复3次取平均值。　　1.4透射电镜观察凋亡细胞　　以不同浓度姜黄素(10、20、30umol/L)作用SiHa细胞24h,胰酶消化收集细胞，离心使细胞成团，分别经过固定、脱水、包埋、固化等，以LKB1型超薄切片机切片，经3%醋酸铀枸橼酸铅双染色，在电镜下观察细胞变化。　　1.5DNA梯状电泳(DNAladder)　　以不同浓度姜黄素(10、20、30umol/L)作用SiHa细胞24h,胰酶消化收集细胞。按照试剂盒说明提取DNA,并溶于无DNA酶的TE液中,20V电泳4h琼脂糖凝胶电泳后,KODAKDNAanalysis2.0凝胶成

6、像系统分析。9　　1.6统计分析　　采用SPSS11.5统计软件包进行t检验分析。　　2结果　　2.1光镜下SiHa细胞凋亡的形态学变化　　正常生长的SiHa细胞为上皮样细胞，帖附生长于培养瓶壁上，细胞平坦。　　姜黄素处理SiHa细胞24h,10umol/L处理组可见细胞间有间隙，细胞形态变化不明显;20umol/L处理组可见细胞变圆,体积缩小;30umol/L处理组可见圆细胞增多，部分细胞脱落悬浮在培养基中。随着姜黄素作用时间增加，以上变化更明显，至72h，细胞坏死。对照组细胞贴壁生长,几乎无脱落,胞质饱满,生长舒展,相邻细胞生长融合成片。　　

7、2.2姜黄素对SiHa细胞增殖的影响　　姜黄素时间剂量依赖性方式抑制SiHa细胞增殖,不同浓度姜黄素(10、20、30umol/L)作用SiHa9细胞不同时间(12h、24h、48h、72h)后，细胞抑制率见图1，与对照组比较，各组差异有显著性意义(P<0.01)。　　2.3透射电镜观察SiHa细胞凋亡改变　　对照组SiHa细胞微绒毛完整而丰富，胞质丰富，胞核无水肿，核膜、质膜完整，核仁清晰。经姜黄素(10、20umol/L)作用的SiHa细胞，可见凋亡发生，微绒毛消失，胞浆空泡;细胞变小、圆，胞质减少，胞膜完整，核膜增厚，染色质碎裂，边集

8、，浓缩，如图2。高浓度姜黄素(30umol/L)作用的SiHa细胞，亦可见坏死细胞，细胞质膜、核膜破碎，细胞崩解，细胞器外溢。　　2.4