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1、聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆第一节概述 PCR(PolymeraseChainReaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤:(1)变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链;(2)退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3)延伸(Extension):在TaqDNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成.由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DN
2、A扩增一倍（图4）,这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达106倍。 一、PCR反应中的主要成份 1.引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：(1)引物长度约为16-30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费,且难以合成。(2)引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度Tm＝4(G+C)+2(A+T).
3、(3)四种碱基应随机分布，在3'端不存在连续3个G或C,因这样易导致错误引发。(4)引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应,以减少由于密码子摆动产生的不配对。(5)在引物内,尤其在3'端应不存在二级结构。(6)两引物之间尤其在3'端不能互补,以防出现引物二聚体,减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。(7)引物5'端对扩增特异性影响不大,可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等.通常应在5'端限制酶位点外再
4、加1-2个保护碱基。(8)引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构,以免产生非特异性扩增,影响产量。(9)简并引物应选用简并程度低的密码子,例如选用只有一种密码子的Met,3'端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0μmol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体,过低则降低产量。利用紫外分光光度计,可精确计算引物浓度,在1cm光程比色杯中,260nm下,引物浓度可按下式计算：Xmol/L＝OD260/A(16000)+C(70
5、000)+G(12000)+T(9600)X:引物摩尔浓度,A、C、G、T:引物中4种不同碱基个数。 2.4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)：dNTP应用NaOH将pH调至7.0,并用分光光度计测定其准确浓度.dNTP原液可配成5-10mmol/L并分装,-20℃贮存。一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200μmol/L。理论上4种dNTP各20μmol/L,足以在100μl反应中合成2.6μg的DNA。当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制TaqDNA聚合酶的活性.4种dNTP的浓度应该相等,以减少合成
6、中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。 3.Mg2+：Mg2+浓度对TaqDNA聚合酶影响很大,它可影响酶的活性和真实性,影响引物退火和解链温度,影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常Mg2+浓度范围为0.5-2mmol/L.对于一种新的PCR反应,可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+进行预备实验,选出最适的Mg2+浓度。在PCR反应混合物中,应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团,例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+离子浓度的物质,以保证最适Mg2+浓度。 4.模板：PCR反应必须以DNA
7、为模板进行扩增,模板DNA可以是单链分子,也可以是双链分子,可以是线状分子,也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好).就模板DNA而言,影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度.一般反应中的模板数量为102-105个拷贝,对于单拷贝基因,这需要0.1μg的人基因组DNA,10ng的酵母DNA,1ng的大肠杆菌DNA.扩增多拷贝序列时,用量更少.灵敏的PCR可从一个细胞,一根头发,一个孢子或一个精子提取的DNA中分析目的序列.模板量过多则可能增加非特异性产物.DNA中的杂质也会影响PCR的效率。 5.Ta
8、qDNA聚合酶：一般TaqDNA聚合酶活性半衰期为92.5℃130min,95℃40min,97℃5min.现在人们又发现许多新的耐热的DNA聚合酶,这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间.TaqDNA聚合酶的酶活性单位定义为74℃下,30min,掺入10nmol/LdNTP到核酸中所需的酶量.TaqDNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率,一般PCR中出错率
