基因敲除技术及应用

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1、基因敲除技术及应用摘要：基因敲除技术是20世纪80年代后兴起的，建立在基因同源重组技术和胚胎干细胞技术基础上的一种分子生物学技术。基因敲除就是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因为目的的一项技术。它克服了随机整合的盲目性和危险性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。基因敲除技术已经在建造动物模型、研究基因的新功能、治疗疾病、创造新物种等方面得到了应用。本文对基因敲除技术及其应用作简单介绍。关键词：基因敲除；同源重组；胚胎干细胞瑞典皇家科学院诺贝尔委员会于2007年10

2、月8日宣布将2007度诺贝尔生理学或医学奖授予美国科学家马里奥·卡佩基（MarioR．Capecchi）、奥利弗·史密斯（OliverSmithies）和英国科学家马丁·埃文斯（SirMartinJ．Evans），以表彰他们在胚胎干细胞研究方面尤其是“基因靶向”技术的发明方面所作的贡献。这三位科学家发现了利用胚胎干细胞对老鼠基因进行特定的改变的原理，从而引出了一种强大技术的发明——“基因靶向”技术，也称作基因敲除技术。1概述1.1基因敲除的概念基因敲除(geneknockout)，又称基因打靶或基因剔除，是通过一定的途径使机体特定的

3、基因失活或缺失的一种分子生物学技术；从分子水平上看，是将一个结构已知而功能未知的基因去除，或者用其它顺序相近的基因取而代之的人工突变技术，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。1.2基因敲除的研究历史基因敲除是自上个世纪80年代开始发展起来的，最初应用于酵母细胞中。808年代初，胚胎干细胞分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。接着就应用于培养哺乳动物细胞，科学家将此技术与胚胎干细胞操作技术相结合，1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的

4、胚胎干细胞基因敲除的小鼠模型。在此后的几年中，基因敲除技术得到了进一步的发展和完善。直到今年，基因敲除小鼠靶向技术的成功，一举获得了2007年度诺贝尔奖。2基因敲除的原理及技术方法2.1原理同源重组在生物界是一个普遍现象。在减数分裂形成配子的过程中，同源染色体上的基因相互交换其同源片断，就是同源重组。基因敲除的原理即仿照了这一过程，这一技术的原理就是：用转基因技术，将外源基因引入靶细胞，通过外源DNA与靶位点上相同核苷酸序列间的的同源重组，使外源基因稳定插入预定的位点，再通过适当的筛选手段得到带有目标基因的细胞。最后，再将重组的干细

5、胞注入动物的体内，观察动物的表型，进而得到正常的纯合体动物。2.2技术方法基因敲除技术的基本过程主要分为两个阶段：干细胞基因打靶和从重组干细胞到基因靶向改造的小鼠。具体步骤如图1所示。2.2.1干细胞培养导入外源基因的受体细胞，要具有从细胞发育成动物个体的全能性。符合此要求的细胞只有干细胞，目前常用的是干细胞的一种即胚胎干细胞（EScell）。胚胎干细胞是从早期小鼠胚泡的内细胞团中分离出来的全能性细胞，在适当条件下能在体外进行增殖而保持不分化的状态。2.2.2构建靶向载体基因敲除技术的关键在于靶向载体（Vector）的构建。设计靶向

6、载体的目的是使之能与受体细胞即胚胎干细胞的特定位点发生重组并使之变异。所以，靶向载体必须包含一定长度的与基因座上相应DNA序列完全同源的序列即一段同源DNA（Homologous8DNA）。载体上还要包含标记基因（如新霉素磷酸转移酶基因neo，单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶基因HSV-tk），以便在转化细胞之后挑选那些整合了载体DNA的细胞，进而在整合了载体DNA的细胞中找出发生同源整合的细胞。常见的哺乳动物基因重组载体有两类，主要依据外源基因整合到染色体基因图1基因敲除技术的基本步骤8位点上方式的不同来区分：第一种是置换型载体：断裂位点

7、位于同源序列区域内，选择基因紧邻同源目的序列，基因重组时整个载体整合到染色体靶位点上，载体DNA同源序列与染色体靶位点进行一次同源重组；第二种是插入型载体：断裂位点位于同源序列区域的外侧或两侧，选择基因位于同源目的序列内部或外侧，基因重组时以载体的同源序列取代染色体靶位序列，载体DNA同源目的序列与染色体靶位点进行两次同源重组。2.2.3转染干细胞将重组DNA转入老鼠干细胞的核内，常用转染的方法。载体与目标基因（Targetgene）发生同源重组（Homologousrecombination），同源重组时，载体的同源区发生重组，同

8、源区以外部分被切除，所以单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶（HSV-tk）基因也被切除而丢失。而新霉素磷酸转移酶（neo）基因，插入载体同源序列中，所以重组时被转入了目标基因中。2.2.4携带目标基因的干细胞增殖由于在高等真核细胞内，外源DNA