增强型绿色荧光蛋白基因转染CHO细胞研究.doc

《增强型绿色荧光蛋白基因转染CHO细胞研究.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、增强型绿色荧光蛋白基因转染CHO细胞研究作者：郑立恒　魏会平　许松梅　孙伟华　李保国　胡火珍　刘全胜【摘要】目的：探讨增强型绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)在中华仓鼠卵巢细胞（CHODHFR）细胞中的作用。方法：将增强型绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pcDNA31(+)EGFP,转染至培养的中华仓鼠卵巢细胞（ChineseHamsterOvary,CHODHFR-）中。结果：成功表达并产生绿色荧光。结论：证明EGFP是一种良好的报告基因和筛选标志，为进一步研究应用最广泛的哺乳动物细胞表达系统―CHO细胞表达系统奠定了基础。【关

2、键词】增强型绿色荧光蛋白；转染；中华仓鼠卵巢细胞eukaryoticexpressionvectorpcDNA31(+)inenhancedgreenfluorescentprotein,EGFPwastransfectedintoChineseHamsterOvary(CHO)cells.CHOcellstransfectedbyEGFPwereselectedbyG418andthenmonitoredundermicroscopeforobservationoftheemissionofgreenfluorescence.Results:Theresultsshowedtha

3、ttheCHOcellstransfectedbyEGFPexpressedgreenfluorescentproteinsuccessfully.Conclusion:ImplyingthatEGFPwasagoodreportedandseletedmarkermoleculeinmammaliancells.ThislaidthefoundationforinvestigationofCHOcellssystemwhichisthemostpopularmammaliancellsexpressionsystem.【KEYWORDS】Enhancedgreenfluoresc

4、entprotein;Transfect;CHODHFR近年来，科学研究者们对从维多利亚水母中克隆得到的绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）这一报告的标记基因产生了浓厚的兴趣[1]，荧光显微可以监视GFP的表达情况，表达时不需要加入抗体、辅因子、酶底物等其他成分，不影响宿主细胞。GFP是一种稳定蛋白，即使在比较高浓度的强毒性药剂（如HCI胍、尿素、硫酸盐等）中延长孵育时间荧光仍可持续存在[2]。因此GFP可以鉴定、跟踪、分选表达GFP的细胞，GFP已成为细胞生物学和分子生物学中广泛应用的报告蛋白[3]。CHODHFR-细胞由于已成功表达了多种重组蛋

5、白而成为公认的工业化生产活性蛋白的重要工具。EGFP基因是在GFP基因基础上改造而来的一种GFP基因的突变体，具有在动物细胞中表达较强荧光的特点。本研究旨在探讨EGFP在CHODHFR细胞中的表达情况。1材料和方法11材料4pcDNA31(+)EGFP质粒，宿主菌BL21由本实验室提供，CHODHFR购自ATCC公司，G418购自GIBCOBRL公司，胎牛血清、质粒回收试剂盒购自SIGMA公司，脂质体购自Roche公司，alphMEM（+）培养基购自Ivitrogen公司，胶回收试剂盒购自博大泰克生物公司。12方法121转化和质粒鉴定将pcDNA31(+)EGFP质粒转化宿主大肠杆

6、菌BL21，在长波紫外灯下筛选鉴定所需的发出绿色荧光的克隆，得到含所需质粒的菌落，进行测序鉴定。122质粒的大量制备和纯化100ml的三角烧瓶内加入含氨苄青霉素（01×10-3g/ml）的LB培养基30ml,含pcDNA31(+)EGFP质粒的细菌培养物1ml,37℃剧烈摇菌过夜，用试剂盒提取和纯化质粒。123细胞培养37℃水浴复苏冻存的CHODHFR细胞，用含10%胎牛血清和双抗的alphMEM（+）培养基，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，3d后传代，当细胞稳定生长后传入25mm培养盘中，当细胞生长至50%~80%融合后进行转染。124基因转染按脂质体转染试剂盒说明书进行操

7、作，实验中设未转染的细胞作为对照。125阳性克隆的筛选和荧光显微镜观察细胞转染24h后换筛选培养基，其中加入G418（400×10-6g/L），三天换液一次，维持筛选作用。期间用普通显微镜观察细胞死亡情况并照相。两周后对照细胞完全死亡，转染细胞单克隆形成，此时进行荧光显微镜观察并照相。2结果21pcDNA31(+)EGFP质粒测序经过测序序列完全正确，得到所需质粒。22pcDNA31(+)EGFP质粒转染CHODHFR细胞后的情况转染的细胞5d后已经大多数死亡，8d后