人骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的实验研究

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山西医科大学硕士学位论文人骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的实验研究姓名：焦强申请学位级别：硕士专业：骨科学指导教师：卫小春20040515 山西医科大学硕士学位论文人骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的实验研究摘要目的建立一种体外分离和培养人骨髓间充质干细胞(BoneMarrow—derivedMesenchymalStemCeils，BMSCs)的方法；探讨BMSCs在单层培养中向软骨细胞定向分化的条件，为软骨组织工程提供种子细胞。方法分别采集3例志愿者骨髓各6ml，用Percoll细胞分离液分离，收集单个核细胞，在含10％胎牛血清的低糖DMEM培养液中培养扩增，流式细胞仪分析BMSCs的表面标志。将培养第3代细胞分为4组：A组为对照组，B组为无血清诱导培养基组(含10ng／ml的rhTGF．D1、丙酮酸钠lmM、地塞米松1o一7M、牛胰岛素6．2509／ml、转铁蛋白6．2599／ml的高糖DMEM培养液)；C组为含5％胎牛血清的诱导培养基组；D组为含10％胎牛血清的诱导培养基组。倒置显微镜下观察细胞生长状况，免疫组化检测II型胶原分泌，原位杂交检测lI型胶原mRNA表达，甲苯胺蓝染色检测蛋白多糖的分泌，，H标记的胸腺嘧啶脱氧核苷(3H—TdR)掺入实验检测细胞的增殖情况。结果经密度梯度离心后，活细胞比例在96％以上。贴壁后的细胞形态均一，由梭形向多角形转变，并一致表达CD9，而CD34、CD38、CD45、CD61呈阴性。B、C组细胞在诱导培养7天后II型胶原免疫组化均为阳性，原位杂交可检测到II型胶原mRNA的表达，甲苯胺蓝染色阳性，而A、D两组分别为阴性和弱阳性。D组细胞增殖最强，而B组细胞最弱，四组细胞3H—TdR摄入量的大小顺序为D>C>A>B。结论密度梯度离心法是一种有效获取人骨髓问充质干细胞的方法，细胞在体外生长稳定，表型均一；10ng／ml的TGF一0l可诱导人骨髓问充质干细胞向软骨细胞方向分化，但在无血清培养基中无法有效的促进细胞的增殖；低浓度的胎牛血清(5％)和10ng／ml的TGF．e1联合作用既可促进入骨髓间充质干细胞的增殖，又可诱导其向软骨细胞方向分化，而高浓度胎牛血清仅对细胞的增殖有促进作用。关键词骨髓，洲充质二{：细胞，转化生长因子B，，分化，软骨细胞 山西医科大学硕士学位论文ExperimentalStudyofInVitroChondrogenicDif托rentiationofHumanBoneMarrow．DerivedMesenchymalStemCellsAbstactObjectivesToestablishamethodofisolatingandculturinghumanbonemarrow—derivedmesenchymalstemcells(BMSCs)；toinvestigatethefeasibilityofinvitrochondrogenicdifferentiationofBMSCsinmonolayercultureaspotentialseedingcellsincartilagetissueengineering．MethodsAvolumeof6mlbonemarrowwascollectedfromthreevolunteerdonorsrespectively．MSCswereisolatedfromthePereollfractionofmononuclearcellsandculturedintheDulbecco’sModifiedEagle’SMedium(DMEM)withlowglucosecontaining10％fetalbovineserum，flowc”ometricanalysiswasperformedtoexaminetheexpressionofcellsurf-acemoleculesonBMSCs，BMSCsfromthethirdpassageweregrownincompletemedium(A)，inductivesemm-freemedium(B)，inductivemediumwith5％fetalbovineserum(C)．inductivemediumwithlO％fetalbovineserum(D)respectively．ThegrowthoftheculturedBMSCswasobserved．ImmunohistochemistryandinsituhybridizationwereappliedtodetecttheexpressionofcollagentypeII．Thesyntheticproteoglycansweredetectedbytoluidinebluestaining．Theproliferationofthecellswasexaminedby3H—TdRincorporation．Results96％cellswerealiveafterdensitygradientcentrifugation．Theadherentcellschangedfromaspindle—likeappearancetoapolygonalshapeandexpressedpositiveCD9，butnegativeCD34、CD38、CD45、CD61．After7daysinductionbyinductiveserum—freemediumorinductivemediumwith5％fetalbovineSerum，thecellswerepositivelystainedbytoluidineblue，immunohistochemistryandinsituhybridizationanalysisprovedstrongtype11collagenexpression．Thesequencesoftheincorporationof3H·TdRwereD>C>A>B．ConclusionsThedensitygradientcentrifugationisaneffectivemethodtoIf ～!堕堕塑查兰堡主兰篁堡苎andwereahomogenouspopulation；lOng／mlTGF-B1carlinducethechondrogenicdifferentiationoftheBMSCs，butitcarlnotfacilitatetheproliferationofthecellsinserum．freemedium；thecombinationofTGF，B1andfetalbovineseruminlowconcentration(5％)cannotonlyfacilitatetheproliferationofBMSCs，butalsoinducethechondrogenicdifferentiation．Keywordsbonemarrow，mesenchymalstemcells，transforminggrowthfactor-beta1，differentia舡on，chondrocytes1II 学位论文独创性声明本人焦强声明，所呈交的学位论文系在导师卫小春教授指导下本人独立完成的研究成果。文中任何引用他人的成果，均己做出明确标沣或得到许可。论文内容未包含法律意义上已属于他人的任何形式的研究成果．也不包禽本人已用于其他学位申睛的论文或成果。与我一同工作的同志刘本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本文如违反上述声明，愿意承担以下责任和后果：1、交刨学校授予的学位证书；2、学校可在相关媒体上对作者本人的行为进行通报；3、本文按照学校规定的方式，对困不当取得学位给学校造成的名誉损害，进行公开道歉。4、本人负责因论文成果不实产生的法律纠纷。论文作者签名：二睦』l与卜一口期：—毒am半年—[月—L上日学位论文版权使用授权书本人完全_r解山西医科大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部fJ或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查词和借阅；本人授权山两医科大学可阻将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学何论文。本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为山西医科大学。m{密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名指导教师签名(本声明的皈权H期：丑垄生年—玉二_月—旺日日期：!=垡生年—』二月上．±，_同终许-u，任何单协及任何个人不得擅自使用) 山西医科大学硕士学位论文前言关节软骨是⋯种高度分化的组织，其损伤后自身修复能力有限。目前临床上治疗关节软骨损伤的策略主要有两种【1】：一种是通过各种方法刺激软骨的内在修复能力，如软骨下骨钻孔术、关节磨削成形术、微骨折清创术等；另一种是通过外科手术移植一些具有修复能力的组织到软骨缺损处促进其外在修复能力，如自体或异体骨软骨、骨膜、软骨膜移植等。但是经过长期随访发现这些方法所形成的修复组织大多为纤维软骨，从结构和功能上与正常的透明软骨组织相差甚远，最终导致疗效不佳伫l。因此如何能有效的修复关节软骨缺损是矫形外科医师面临的一大难题。近年来，随着细胞生物学和生物材料科学的发展，诞生了～门新的学科——组织工程学。其核心是利用少量的种子细胞经过体外培养扩增，并附着在一定的支架材料上移植到体内而形成新的有生命力的组织。软骨组织工程被认为是最有可能解决关节软骨损伤后修复的方法之一【3】。组织工程涉及到三个方面，即种子细胞、生长因子、支架材料。其中如何获得高效、大量的种子细胞是组织工程的关键”】。最近，一些研究报道运用自体软骨细胞移植可修复关节软骨缺损【5】。这种方法需要通过关节镜手术从患者体内取出一定量软骨，然后在体外进行消化分离得到软骨细胞，培养扩增到一定数量后再移植回患者体内软骨缺损处进行修复。该方法依靠成熟的软骨细胞进行修复，然而研究发现软骨细胞在体外单层培养过程中会发生去分化(dedifferentiation)现象【6J，且两次手术增加了患者的经济负担，软骨细胞分离培养技术难度较高，这些因素限制了该技术在临床上的推广应用口】。间充质干细胞(MesenchymalStemCells，MSCs)是一种广泛分布于人体内的未分化细胞。浚细胞在适当的诱导环境中可分化成软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞等多种间充质细胞日】。骨髓中的问充质干细胞(BoneMarrow—derivedMesenchymalStemCells，BMSCs)更是具有取材方便、体外易分离扩增等特点，并经动物实验证实可同时修复关节软骨和软骨下骨的损伤，因此成为软骨组织工程中一种理想的种子细胞【9J。但目前列BMSCs向软骨细胞定向分化的机制研究尚不完全清楚。国外一些研究采用体外聚 集培养系统，经TGF．131作用后证实可诱导BMSCs成软骨分化【lm“】。其中聚集培养系统模拟了胚胎软骨的发育过程，而TGF．Dl则提供了软骨发育过程中所需的外源信号[1⋯。但由于该方法形成的是细胞团，得到的细胞数量有限，很难满足组织工程对种子细胞的数量要求。与此相反，在自体软骨细胞移植术中，通过体外单层培养方法可大量扩增软骨细胞。但在单层培养中诱导人BMSCs向软骨细胞分化的研究报道很少。本实验在预实验的基础上分别设计了含TGF一13，的无血清和含血清诱导培养基，探索体外单层培养中促进人BMSCs增殖及向软骨细胞分化的条件，为临床上应用自体骨髓问充质干细胞为种子细胞组织工程化修复关节软骨缺损奠定基础。 山西医科大学硕士学位论文1主要仪器细胞培养箱超净工作台倒置显微镜流式细胞仪2主要试剂材料与方法BB5060型(Heraeus公司)BCM一1000型(苏州空气净化器厂)XSZ．D2(重庆光学仪器厂)EPICSELITE—ESP(Coulter公司)胎牛血清(北京军区兽医研究所)，DMEM培养基、胰蛋白酶、两性霉素B(Sigma公司)，rhTGF一6l(TBD公司)，地塞米松(国产)，丙酮酸钠、牛胰岛素、转铁蛋白(Sigma公司)，II型胶原多克隆抗体、II型胶原原位杂交试剂盒、SABC试剂盒(博士德公司)，Percoll细胞分离液(Pharmacia公司)，CD34．FITC、CD38一FITC、CD45．FITC、CD9．FITC和CD61一FITC单克隆抗体(Immuontech公司)。3人骨髓间充质千细胞的分离和培养3．1细胞分离和原代培养志愿者3例，男2例，年龄分别为15岁、46岁，女1例，36岁，排除有其它疾患，无菌条件下从志愿者髂前上棘抽取骨髓6ml(含肝素O．2m1)。用等量DMEM培养液与之混匀，缓慢加至等体积的Percoll细胞分离液(比重1．073)上，1500rpm离心20min，收集最上层培养液中及培养液一分离液交界处的单个核细胞，置于无菌试管内，D—Hank’s液清洗2次，用人BMSCs完全培养基(含10％胎牛血清、青霉素100u／ml，链霉索100pg／ml，两性霉素B299／ml的低糖DMEM培养液)制成单细胞悬液，计数细胞，胎盘蓝拒染法测定细胞活力。以5x105／ml的密度接种于75cm2培养瓶中，置于5％C02、饱和湿度、37。C培养箱中。培养第3天首次换液，换液时将培养液中悬浮的细胞离心收集后置入原瓶内继续培养，以后每周换液2次，不再收集悬浮细胞。倒霞显微镜下逐日观察细胞形态及生长情况。3．2传代培养待细胞融合后，倾去培养液，用D．Hank’S液清洗1次。加入10m10．25％胰蛋白酶溶液，37℃消化3-5min，见细胞问出现间隙，细胞咧缩成圆形后加入含10％胎牛血清的培养液终止消化。用吸管轻轻吹打细胞，直至贴壁3 山西医科大学硕士学位论文细胞悬浮，吸取细胞悬液离心沈涤1次，用人BMSCs完全培养基制成单细胞悬液，按1：2进行传代培养，此时的细胞称为第1代传代细胞(P1)。同法进行第2～3代传代培养。4流式细胞仪分析P3代细胞培养至接近融合时，用含O．25％胰蛋白酶的磷酸盐缓冲液(PBS)将细胞消化下来(方法同上)，PBS洗涤1次，制成单细胞悬液，密度调整为1×106／ml。用PBS洗涤细胞，室温下与CD34一FITC、CD38．FITC、CD45．FITC、CD9一FITC和CD61一FITC单克隆抗体孵育15分钟。再以PBS洗涤细胞后重悬细胞于O．5ml含l％多聚甲醛的PBS中固定。以同型对照单克隆抗体确定背景标记。用流式细胞仪分析荧光细胞。5体外诱导向软骨细胞分化将P3代细胞以1×105／ml接种至六孔培养板中，六孔板中预置盖玻片，培养24小时后更换培养液，并将细胞培养分为4组：A组为对照组，培养液为人BMSCs完全培养基(含10％胎牛血清、青霉素100u／ml，链霉素100,g／ml，两性霉素B2pg／ml的低糖DMEM培养液)；B组培养液为无血清诱导培养基(含10ng／ml的rhTGF．Bl、丙酮酸钠lmM、地塞米松lO。M、牛胰岛素6．2509／ml、转铁蛋白6．25"g／ml的高糖DMEM培养液)；C组为含5％胎牛血清的诱导培养基；D组为含10％胎牛血清的诱导培养基。将六孔板置于5％C02、饱和湿度、37"C培养箱中培养，每周换液2次。培养7天后取出铺有细胞的玻片，进行以下检测。5．1Ⅱ型胶原SABC法免疫组化染色取出玻片，PBS漂洗2次，4％多聚甲醛室温固定20min，新鲜配制O．5％H202／甲醇室温浸泡30min以灭活内源性过氧化物酶，滴加封闭液室温作用20rain封闭非特异性结合位点，滴加l：150的兔抗人II型胶原抗体(一抗)，37。C孵育1h后滴加生物素化山羊抗兔IgG(二抗)，37℃孵育20min，SABC37℃反应20min，DAB显色15min，苏木素轻度复染，脱水、透明，中性树脂割片。用PBS代替一抗作为空白对照，以软骨细胞作为阳性对照。5．2II型胶原原位杂交取出玻片，PBS漂洗2次，4％多聚甲醛室温固定20rain，新鲜配制o．5％H202／F0醇室温浸泡30rain以灭活内源性过氧化物酶，3％柠檬酸新鲜4 稀释的胃蛋白酶作用10s暴露mRNA核酸片段，每张玻片滴加20Ijtl预杂交液，37。C预杂交2h，再加209l杂交液，37℃杂交过夜，滴加封闭液37℃作用30min，生物素化鼠抗地高辛37℃作用60min，SABC37℃反应20min，生物素化过氧化物酶37℃作用20rain，DAB显色15min，苏木素轻度复染，脱水、透明，中性树脂封片。以PBS代替杂交液作为空白对照，以软骨细胞作为阳性对照。5．3甲苯胺蓝染色取出玻片，PBS漂洗2次，4％多聚甲醛室温固定20min，甲苯胺蓝液作用30min，水洗，冰醋酸液分化数秒钟，脱水、透明，中性树脂封片。以软骨细胞作为阳性对照。6细胞增殖性检测将P3代细胞分为4组(同五)，进行，H—TdR掺入实验检测：①各组细胞以lxl04／孔接种至96孔培养板中，每组6孔。②当细胞生长至汇合时，吸除培养液，用无血清培养液洗涤1次后，每孔加入509l无血清培养液和1“Ci3H—TdR，孵育24h。③终止培养，吸弃培养液，每孔加O．1MNaOHl00p1裂解细胞24h。④收集裂解液入闪烁瓶中，加入闪烁剂，暗室反应3h，液闪记数仪测定各孔每分钟脉冲数(cpm)。7统计学方法：应用SPSSl1．0统计学软件进行数据统计学处理，结果以均数±标准差(X±S)表示，采用方差分析，计算尸值。 结果1骨髓间充质千细胞的分离和培养1．1本实验采用密度梯度离心法，平均每毫升骨髓可获得单核细胞约1×107个，经胎盘蓝拒染法测定，活细胞比例在96％以上。1．2倒置显微镜观察原代细胞接种培养24小时后，可见部分细胞贴壁，贴壁的细胞大多呈圆形，在培养瓶边缘可见有少数细胞呈梭形(图1)。48小时后，贴壁的单核细胞数量增多，细胞形态向椭圆性或梭形转变。72小时后，贴壁的细胞间可见有细胞集落形成，细胞大多呈长梭形，细胞核较大，胞质中颗粒明显，有的细胞逐渐伸出伪足，向多角形细胞转变。随若细胞分裂增殖，集落的体积越来越大，数量也逐渐增多(图2)。3天后首次换液，换液时将培养液中悬浮的细胞离心收集后置入原培养瓶内继续培养。经2～3次换液后，骨髓中的造血细胞不贴壁，逐渐被清除掉。14～2l天细胞集落相互融合成单层，铺满瓶底，而集落中央可见细胞排列密集，叠加成多层细胞层(图3)。细胞传代后，贴壁速度增快，12小时后可见大多细胞贴壁，细胞呈梭形或多角形，排列有一定方向性，生长迅速。P3代细胞中，A、C、D组细胞生长良好，7天左右细胞可铺满玻片，随培养时间延长，细胞形成多层细胞层，无细胞间的接触抑制现象。B组细胞培养至第3天，边缘可见少数细胞形态细长，似生长状况不良，第5天时可见边缘有部分细胞开始从玻片上脱落、悬浮，第7天时可见边缘脱落细胞增多，并由四周向中央扩散，因此终止培养(图4)。2流式细胞仪分析结果流式细胞仪分析结果表明体外培养扩增的人骨髓间充质干细胞表达CD9+，出现荧光单峰，而不表达造血细胞及其它细胞表面标志，如CD34’、CD38。、CD45一、CD61一(图5)。3体外诱导向软骨细胞分化3．1免疫组化结果B、C组细胞诱导培养7天后II型胶原免疫组化均为阳性，阳性细胞胞浆内可见棕黄色颗粒，细胞周围也出现黄染区(图6．2、图6—3)。A、D6 两组II型胶原免疫组化为阴性和弱阳性(图6．1，图6．41。3．2原位杂交结果B、C组细胞诱导培养7天后II型胶原mRNA表达均为阳性，可见棕黄色颗粒分布于细胞胞浆内(图7—2、图7．3)。A、D两组II型胶原mRNA表达为阴性和弱阳性(图7—1，图7-4)。3．3甲苯胺蓝染色B、C组细胞甲苯胺蓝异染阳性，核呈紫色，胞浆呈深蓝色，说明细胞分泌粘多糖物质(图8—2，图8—3)。A、D组细胞甲苯胺蓝染色呈阴性和弱阳性(图8．1，图8-4)。4细胞增殖性检测结果四组细胞3H—TdR掺入实验检测结果见图9。图9显示TGF—Bl在5％胎牛血清和10％胎牛血清的协同作用下均可明显增加MSCs的3H—TdR掺入(与完全培养基组相比较，P<0．05)，两组比较又以在t0％胎牛血清中的作用最强(PC>A>B(P2cm2)缺损的主要方法之一【3】。但目前在国内仅见个例报道l”。本文就ACT的基础研究和临床应用综述如下。一、基础研究关节软骨损伤后自身修复能力差，部分原因可能与关节软骨缺乏血液供应和有修复能力的细胞有关。ACT正是通过外科手术将一定量有修复能力的软骨细胞运送到缺损处以促进软骨的修复。这其中一个关键问题就是移植前后软骨细胞表型的稳定。研究表明软骨细胞在体外单层培养过程中，会发生表型的改变，即由分泌II型胶原和软骨特异性蛋白多糖转为分泌I型胶原和低水平的蛋白多糖为主[5】。软骨细胞这种体外去分化(dedifferentiation)现象被认为可能反映了细胞经移植后在体内会逐渐失去生成稳定软骨的潜力，进而会影响ACT的长期效果【6l。因此在细胞移植阿，有必要对所移植的细胞进行表型的鉴定。Benya和ShafferfS／研究发现将去分化的兔软’胃+细胞培养至琼脂中，细胞可重新表达其分化表型。Brittberg[21(王i1Ai床应用ACT时，使用了上述方法对移植前的软骨细胞进行表型鉴定，以证明所移植的软骨细胞表型稳定。但Dell’Accio等扣J研究发现将体外培养成人第5代软骨细胞(已去分化)经琼脂培养后，细胞虽可重新表达II型胶原，但这些细胞经注射到裸鼠肌肉内时却没有形成软骨组 山西医科大学硕士学位论文织，而对于表型稳定的软骨细胞，经注射后可在裸鼠肌肉中形成稳定的软骨组织，因此认为琼脂培养不能作为预测软骨细胞表型稳定的方法。同时研究表明成纤维细胞生长因子受体3(fibroblastgrowthfactorreceptor3．FGFR一3)、骨形态发生蛋白2(bonemorphogeneticprotein2，BMP一2)、II型胶原a1链(COL2A1)在移植前软骨细胞中的高表达与移植后软骨细胞在体内表型稳定呈正相关，激活素受体样激酶1(activinreceptor，likekinase1,ALK．1)的表达上调则提示软骨细胞将失去在体内生成稳定软骨的能力。最近，Tallheden等口]研究发现在体外不同培养环境诱导下，人软骨细胞不仅可生成软骨组织，而且可分化成脂肪细胞，分泌钙化基质。软骨细胞这种表型可塑性(phenotypicplasticity)与间充质干细胞有些类似，虽然原因还不清楚，但有可能是ACT术后长期效果良好的一个因素。二、动物实验]984年，Peterson等【嘲建立了一种运用自体软骨细胞移植修复兔髌骨软骨缺损的模型。运用这种模型，Grande等【9]检测了体外扩增的自体软骨细胞对软骨缺损修复的作用。为了确定重建的软骨组织是否来源于所移植的软骨细胞，在移植前用核素示踪物将这些细胞进行了标记。术后对移植物样本大体观察可见滑膜炎及其他退行性改变明显减少。在接受细胞移植治疗的缺损区，软骨重建达82％，而空白对照组仅为18％。放射自显影显示移植的软骨细胞参与了软骨的重建。此后，Brittberg[101又将这种模型进一步发展爿奇经体外培养扩增后的自体软骨细胞移植到预先制成的兔髌骨软骨缺损处(直径3ram，未穿透软骨下骨)，表面再覆盖一片骨膜。术后长达一年的结果显示软骨缺损修复良好，修复组织为透明样软骨组织，且逐渐成熟。这些成功的动物实验是ACTl临床应用的基础。但是在评估这些动物实验的结果以及与临床的联系时，仍需考虑到其他因素⋯J。Breinan等|】副在犬模型上比较了单纯骨膜移植与自体软骨细胞联合骨膜移植治疗软骨缺损的效果。术后12～18个月的结果显示两者无明显差别。这可能与犬的软骨卜骨相对薄，术。p容易被穿透而危害修复组织有关。而兔髌骨的软骨下骨很硬，在细胞移植过程中很难被击穿l”]。另外Wei等[14】研究发现兔膝关节不同区域的软骨厚度也不同。位于殷骨髁和胫骨平台内侧区的软骨要比外侧区韵软骨厚，而股骨髁后方区域的软骨又较前方的厚。出此可见实验29 动物的种类及模型制造不同都会影响实验的结果，进而会影响到动物实验与临床应用的联系。因此Hunziker[11】指出在进行动物实验前，研究者要全面了解人和所选择动物的关节软骨生物特性、结构特征，这样才能制造出更为理想的模型。三、临床应用1994年，Brittberg等【21首次报道了临床应用ACT的情况。首批接受治疗的23例病人(平均年龄27岁)中，16例为股骨髁软骨损伤，7例为髌骨缺损。术后经过16～66个月(平均39个月)的随访，所有病人的膝关节肿、痛等症状均减轻，绞锁症状消失。其中共有16例患者的膝关节功能评分为优良。良好的效果使ACT获得临床的认可，并在1997年，自体软骨细胞培养作为一种生物制剂获得了美国食品和药品监督局(FDA)的批准(CarlieellM)，使ACT临床应用更加规范化。1．适应证目前认为ACT的适应证为：由外伤或剥脱性骨软骨炎所导致的股骨髁、滑车局限性全层软骨或骨软骨缺损。患者年龄一般在15～55岁之间，且膝关节无骨关节炎等改变，损伤面积在2～16cm2间‘15,161。2．手术过程手术一般分为两步。第一步通过关节镜从股骨髁非负重区取得一定量软骨，在体外进行清洗、消化、分离得到纯软骨细胞，然后接种培养、增殖。第二步需切开关节，距第一次手术约14～21d。将病灶清创至周围正常软骨处，避免穿透软骨下骨而引发创面出血，测量缺损处的大小。然后从胫骨近端取下一片面积较缺损区稍大而形状相似的骨膜片。确认缺损区无出血后将骨膜的生发层朝向骨面覆盖缺损处，用可吸收缝线将其缝合至缺损区周围软骨上，缝合处用纤维胶封盖。将体外培养的软骨细胞悬液从预留的缺口处注入，闭合缺损，逐层缝合伤口，弹性绷带包扎。3．术后康复手术完成后，一个详尽的康复训练计划非常重要。康复训练要根据患者的状况、需求、软骨损伤的大小、部位以及是否合并有其它手术治疗等不同情况而制定相应的计划。一般术后6～24h开始进行膝关节持续被动活动(CPM)。对于股骨髁软骨损伤活动范围一般为0。～45。，滑车损伤为O。～30 山西医科大学硕士学位论文30。。前2周每天锻炼8～lOh，活动范围可逐日递增5。～10。，但最大屈曲不能超过90。。前6～8周为非负重期，随后10～12周可以逐渐增强锻炼直到完全负重№”l。术后9～10个月可进行跑步锻炼，而一些高强度的活动要到术后12～15个月才可进行[181。术后锻炼主要有三个目的【191：通过逐步增加活动度(ROM)的训练等促进软骨细胞再生，减少关节粘连。术后6周尽量避免负重是为了避免骨膜承受负荷过大和移植物中心退变、分层。通过肌肉等长训练来阻止肌肉萎缩和加强肌肉张力。4．术后评估术后的结果主要由以下几个方面进行评估：通过各种评分法对临床效果综合评分：通过关节镜检、MRI等对修复组织进行观察；运用组织化学等方法对修复组织结构进行测定：对修复组织进行生物力学测定。目前大量的文献报道均表明ACT可有效的改善病人的症状，如膝关节疼痛、绞锁、肿胀等。经治疗后，大部分病人不仅恢复了正常的生活活动，而且许多人还可以重新进行娱乐和体育活动[3,15,16,17,18】。Peterson[17]在关节镜下观察到术后2～3个月内，移植物非常软，到6～8个月时开始变硬，9～12个月时修复组织与周围正常关节软骨的硬度十分接近。MRI作为一种无创检测技术，经常被用作评估软骨的损伤及修复。其中一种新型的M尉技术——钆延迟增强软骨磁共振成像技术(delayedgadolinium—enhancedmagneticresonanceimagingofcartilage，dGEMRIC)对软骨中的糖胺多糖(GAG)具有高度的敏感性和专一性‘”1。该技术通过静脉注射阴离子造影剂钆喷酸葡胺(Gd(DTPA)2‘)，使之充分渗透到软骨中。Gd(DTPA)2。存软骨中的分布与GAG的浓度成反比，而Gd(DTPA)2对MRI的T，参数又有一定影晌(该影Ⅱ向呈浓度相关性)。因此通过T1成像就可反映出软骨中Gd(DTPA)2的浓度大小，进而可得到组织中GAG的浓度。Gillis等川运用dGEMRIC测定修复组织中GAG的浓度发现12个月内的移植物中GAG浓度低于周围远处软骨：12个月以后，修复组织中GAG的水平与1l 周围临近和远处软骨中的相似。Richardson等i2lJ取术后12个月的修复组织，运用组织化学方法证实修复组织具有明显的层异质性。表层为纤维软骨组织，胶原以I型和III型为主；而深层组织从形态与结构上与正常的透明软骨都相似，修复组织与软骨下骨整合完好。Lyyra等f22】研制出～种关节镜下压痕试验器械(arthroscopicindentationinstrument)，可在关节镜下直接对软骨组织的硬度进行定量检测。该器械由测量杆组成，可在关节镜下进入膝关节。杆的末端为一倾斜20。的参照板(referenceplate)，参照板中央为压痕头(indenter)。测量时，手术医生用参照板压迫软骨表面，通过施加一个恒定的力使软骨表面产生相应的抵抗，然后通过压痕头所检测到的抵抗力大小来反映软骨的硬度。Peterson等[23]运用这种器械对ACT术后患者进行检测，发现透明样软骨修复组织的硬度与周围正常软骨相近，而纤维性修复组织则远低于正常软骨。5．疗效分析作为一项新技术，ACT的疗效是建立在对大量病人长期随访的结果上的。2000年Peterson[”】报道了101例膝关节软骨缺损的病人接受ACT治疗的情况，其中94例经过2～9年的随访。结果显示各组病人经治疗后临床效果的优良率分别为：局限型股骨髁损伤组为92％，多发性软骨损伤组为67％，剥脱性骨软骨炎组为89％，髌骨软骨损伤组为65％，股骨髁合并前交叉韧带损伤组为75％。Micheli等【16]对美国19个治疗中心共50例接受ACT治疗的患者进行了平均3年的随访，有效率达84％。统计学表明术后临床效果的提高与患者年龄、性别、损伤的性质(急性或慢性)、以前接受骨髓刺激术治疗而失败、术中同时是否接受其他治疗以及缺损的大小都无明显关系。Minas[3]通过对169例经ACT治疗的患者1～2年的随访，报道有效率达87％。作者认为ACT可作为临床上治疗有膝关节软骨较大面积(>2cm2)缺损且对日常活动要求较高的患者的一线治疗方案，而对那些对日常活动要求一般且接受骨髓刺激术治疗失败的患者，ACT可作为修j卜术。最近，Peterson等【24]报道了对58例经ACT治疗后的剥脱性骨软骨炎的患者长达2～10年的随访结果，显示临床成功率在90％以上。这些患者的损伤主要局限在股骨髁，损伤面积平均为5．7em2，损伤深度平均为7．8mm。作1’ 者认为损伤深度超过8～10mm时，ACT应联合自体骨软骨移植治疗，并推荐可广泛应用ACT治疗此症。还有作者报道ACT治疗肘关节[25】、踝关节【26】等处的剥脱性骨软骨炎所致软骨缺损，疗效满意。另外有关ACT与其他软骨修复方法相比较的研究也在进行。Horas等【27】通过前瞻性研究，比较了自体软骨细胞移植与自体骨软骨移植对40例股骨髁局限性软骨损伤患者治疗2年的效果。结果表明两种方法均减轻了患者的症状。然而ACT治疗组的效果比自体骨软骨移植组出现迟。Bentley[”]等研究了loo例需要软骨修复的患者随机接受ACT或镶嵌式软骨成形术(mosaicplasty)治疗的效果。结果显示ACT组临床效果优良率为88％，镶嵌式软骨成形术组为69％。术后一年关节镜检发现ACT组修复优良率达82％，而“马赛克”软骨成形术组仅为34％。但这些研究还需通过对大量病例长期随访来进一步证实。四、展望在软骨修复领域中，ACT是第一项将动物模型成功转化成I临床实践的技术。在长期的临床应用中，ACT取得了较满意的疗效，但同时也暴露出一些缺陷：如软骨细胞可能从移植物区向外泄露；移植物区的细胞在重力等原因影响下会分布不均，从而使再生的软骨面不平整；移植前，软骨细胞在体外单层培养中发生去分化及骨膜肥大等[18,251。而且临床应用ACT还存在费用高、技术复杂、需关节切开等问题。ACT的技术仍需不断改进。最近，Ochil29]等报道了体外用组织工程技术生成软骨样组织在临床应用的结果。作者将体外分离的软骨细胞接种到胶原蛋白凝胶(Atelocollagengel)中培养2l～26天后移植到患者软骨缺损处进行修复。在接受治疗的26例病人中，股骨髁损伤患者的优良率达88％；3例髌骨损伤患者的治疗效果优良，都恢复了正常的活动。Ateloeollagengel是一种经过处理去除了抗原决定簇的I型胶原。实验和临床结果都证实它可维持软骨细胞的表型，减少细胞泄露，使细胞能均匀分布在移植区，且无免疫反应的风险。Grandep0J等以聚乳酸(PLA)为材料研制出一种固定装置。该装置可在关节镜卜-连同软骨移植物(PGA)一同被运送到软骨缺损区，并将移植物同定到软骨下骨上，从而避免移植物脱落。动物实验证实PLA的降解速率慢，并不影响软骨修复。由以上可看出ACT的发展正逐渐与组织工程技术相结合。相信随33 山西医科大学硕士学位论文着研究的深入，ACT的技术和疗效会得到进一步完善，手术有望完全实现微创性，即全部在关节镜下进行手术，可减少手术步骤的繁杂及传统关节切开的风险，降低手术费用，缩短康复时间。参考文献1、ChestermanPJ，SmithAU．Homotransplantationofarticularcartilageandisolatedchondrocytes：anexperimentalstudyinrabbits．JBoneJointSurg(Br)，1968，50：184—197．2、BrittbergM，LindahlA，NilssonA，eta1．Treatmentofdeepcartilagedefectsinthekneewithautologouschondrocytetransplantation．NEnglJMed，1994，331：889—895．3、MinasT．Autologouschondrocyteimplantationforfocalchondraldefectsoftheknee．ClinOrthop，2001，391(Suppl)：$349一$361．4、刘尚礼，李卫平，宋卫东．软骨细胞移植治疗关节软骨缺损．广州医药，2000，31：1-4．5、BenyaPD，ShafferJD．Dedifferentiatedchondrocytesreexpressthedifferentiatedcollagenphenotypewhenculturedinagarosegels．Cell，1982，30：215-224．6、Dell’AccioF，DeBariC，LuytenFP．Molecularmarkerspredictiveofthecapacityofexpandedhumanarticularchondrocytestoformstablecartilageinvivo．ArthritisRheum，2001，44：1608-1619．7、TallhedenT，DennisJE，LennonDP，eta1．Phenotypicplasticityofhumanarticularchondrocytes．JBoneJointSurg(Am)，2003，85(Suppl2)：93一1008、PetersonL，MencheD，GrandeD，eta1．Chondrocytetransplantation：anexperimentalmodelintherabbit．TransOrthopResSoc，1984，9：218．9、GrandeDA，PitmanMI，PetersonL，eta1．TherepairofexperimentallyproduceddefectsinrabbitarticularcartilagebyautologouschondrocytetransplantationJOrthopRes，1989，7：208—218．10、BrittbergM，NilssonA，LindahlA，etalRabbitarticularcartilagedefectstreatedwithautologousculturedchondrocytes．ClinOrthop，1996，326：34 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个人简介焦强，男，汉族，1979年出生于山西省晋城市，党员，医学硕士。1996年～2001年就读于山西医科大学临床医学系，2001年～2004年于山西医科大学第二附属医院攻读骨外科硕士。硕士研究生期间发表文章1、自体软骨细胞移植修复关节软骨缺损．中华骨科杂志，2004，24(3)：184—186．2、骨髓问充质干细胞成软骨分化研究进展．实用骨科杂志，2004，10(3)．3、人骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的实验研究。中华实验外科杂志，已录用．4、人骨髓间充质干细胞体外向软骨细胞分化的研究．中华医学会第七界全国骨科学术会议论文汇编收录． 致谢衷心感谢导师卫小春教授三年来给予我无微不至的关怀和谆谆教诲。从课题的设计、实施到论文撰写的整个过程中，导师都给予了精一i5指导，尤其是对我的论文字斟句酌，字里行间都凝聚着导师的心血。他严谨的治学态度、高尚的学术道德、精湛的医术和敬业的精神使我终生受益，并值得我一生去学习与追求。感谢山西医科大学第二医院骨科高富贵主任、钟英斌主任、吕智教授、张志强教授、纪斌平教授、李立志医师、尹岜医师、黄永波医师及全体医护人员在标本采集及临床工作过程中给予的大力支持和帮助。感谢山西医科大学第二医院骨科实验室李鹏翠、丁娟、杨自权、郝一勇、陈崇伟、任步方、向川1、高刚、陆向东，骨科田江华老师，血液科实验室朱镭，风湿科实验室胡学芳、李雪飞，麻醉科温建忠，放射性同位素实验室田淑华老师，课题得以顺利完成，离不开你们无私的关怀与帮助。感谢家人多年来对我学习和生活上默默支持与无私奉献，您们的理解是我不断进取的源泉!感谢三年来所有帮助过我的老师、同学及朋友!