骨髓间充质干细胞向软骨细胞诱导分化影响因素的探讨

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骨髓间充质干细胞向软骨细胞诱导分化的影响因素张永强杨自权卫小春*山西医科大学第二临床医学院骨关节科030001摘要：骨髓间充质干细胞（BMSCs）具有成软骨能力，但影响其向软骨细胞分化的因素很多，如培养基条件，血清，培养方式，传代次数，接种密度，低氧，力学刺激，细胞因子，支架材料和基因修饰等。只有将这些影响因素优化组合，才能发挥BMSCs成软骨的最大效应。关键词：骨髓间充质干细胞；软骨细胞；培养基；血清；传代；密度；低氧；力学刺激；细胞因子；材料；基因修饰Abstract:Bonemarrowmesenchymalstemcells(BMSCs)havethepotentialofdifferentiatingintocartilage.Buttherearemanyinfluentialfactorsintheirchondrogenicprocess,suchasthemediumconditions,serum,culturemode,passages,inoculationdensity,hypoxia,mechanicalstimulation,cytokine,scaffoldmaterials,geneticmodificationandsoon.Onlyoptimizedcombinationofthesefactorscanmakemorebonemarrowmesenchymalstemcellsdifferentiateintochondrocytesbetter.Keywords:Bonemarrowmesenchymalstemcells;chondrocytes;medium;serum;passages;density;hypoxia;mechanicalstimulation;cytokine,scaffold;geneticmodification软骨组织工程的研究发展为关节软骨损伤的修复带来了新的希望。骨髓间充质干细胞具有分化为骨、软骨、肌腱、脂肪等组织的多分化潜能[1]，已成为理想的种子细胞之一，也是目前软骨组织工程的研究热点。骨髓间充质干细胞在修复软骨损伤时 ，无论在体内体外，都必须经历向软骨细胞分化的过程，在此过程中有着诸多影响因素，目前在这方面的研究亦较多。现将影响骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的多方面因素进行综述。1细胞培养1.1分离方法从骨髓中分离骨髓间充质干细胞的方法主要有贴壁法、密度梯度离心法、免疫磁珠或流式细胞仪分离法[2]。前两者因为简单有效所以应用较多。Wang等[3]应用贴壁法和密度梯度离心法分别培养BMSCs,并在同种条件下向软骨细胞诱导分化，最后用免疫组织化学染色和原位杂交法鉴定两组Ⅱ型胶原及Ⅱ型胶原mRNA表达，结果显示两种方法分离的BMSCs均能成功的诱导分化为软骨细胞且无明显差别。但有研究表明：通过贴壁法培养的细胞在纯度、活性、生物学形态和特征、增殖传代能力方面更优于密度梯度离心法[4-5]。1.2培养基a-MEM、DMEM-LG、DMEM-HG、DMEM、DMEM-F12是目前在BMSCs培养过程中应用较多的培养基。绝大多数实验室采用DMEM-LG培养基进行BMSCs的分离与扩增，少数实验应用DMEM-F12、a-MEM、DMEM、DMEM-HG进行，因为低糖条件比高糖条件更利于BMSCs的增殖[6]。但Majumdar等[7]比较了DMEM-LG，a-MEM培养基对间充质干细胞生长的影响，认为a-MEM中培养的细胞较DMEM-LG具有更高的集落形成率和促增殖作用。然而，Coelho等[8]却发现a-MEM和DMEM-HG 对人骨髓间充质干细胞的增殖能力没有明显的影响。大多实验室用DMED-HG构成的完全诱导培养基诱导BMSCs成软骨分化。目前，国内外有关培养基对BMSCs向软骨细胞诱导分化影响的研究较少，还需进一步探讨。1.3血清虽然无血清培养基在细胞培养中也有所应用，但因其添加的成分价格昂贵，体外培养操作复杂，不利于大规模产业化生产，而在应用上受到了限制，所以血清在细胞培养过程中显得至关重要。Shahdadfar等[9]研究表明：自体血清和胎牛血清都有利于人BMSCs增殖，胎牛血清更佳，两种血清对人BMSCs的形态和表型均无影响，但在分化水平上自体血清不如胎牛血清。同种异体人血清不利于BMSCs增殖，而且会导致细胞生长停滞以及死亡。刘一天等[10]用含有不同浓度胎牛血清的诱导液对BMSCs向软骨细胞诱导分化，结果表明浓度为10%的胎牛血清有利于BMSCs向软骨细胞分化。血清中除了含有已知的白蛋白、脂类、维生素、糖类等物质外，血清中还含有一千余种未知的化学成分，这些已知和未知的血清成分均有可能对BMSCs的成软骨分化和组织形成产生重要的影响[11]。但具体是哪些成分对BMSCs向软骨细胞分化有促进作用及其具体机制如何，这些问题还有待研究。1.4培养方法目前，很多实验室培养BMSCs都是应用平面培养瓶二维静态培养，但研究表明在促进BMSCs向软骨细胞分化方面三维培养环境优于二维环境，动态培养优于静态培养[12-13]。Johnstone等[14] 于1998年首先提出了三维培养体系，将BMSCs制成高密度细胞微球，在这种三维培养体系中，成功地使BMSCs分化为软骨细胞。PITTENGER等[15]通过离心使BMSCs形成小的团状沉淀，然后静置培养，10-14d后，细胞形态由梭形变为肥大软骨细胞状，表达软骨细胞的特异分子标记物Ⅱ型胶原及胞外基质中蛋白聚糖丰富。并且，随着培养时间的推移，具有软骨细胞分子标记物的细胞数量越来越多。培养3个月，通过组织学观察可见软骨细胞样陷凹。将三维支架材料与细胞复合培养也是给细胞提供一个三维培养环境。三维培养环境将细胞外基质良好的固定与细胞周围，有利于细胞外基质发挥对细胞增殖分化及代谢的调节作用[16]。动态培养采用生物反应器，目前应用较多的生物反应器主要为微重力旋转生物反应器和流体灌注式生物反应器。微重力旋转生物反应器是模拟细胞生存的体内微重力环境，使细胞承受较低的剪切力，提高细胞内外、细胞间物质传递效率，从而提高细胞分化质量[17]。王会才等[12]研究表明：微重力条件下动态诱导BMSCs细胞外基质成分胶原和蛋白多糖产量均高于非微重力组，三维动态培养组效果最佳，提高了软骨细胞分化的质量和效率。流体灌注式生物反应器是模拟软骨细胞在体内的间歇性生理液态压力条件。Carver等[18]发现在间歇性生理液态压力下，于PGA网上培养5周的马的软骨细胞，可明显促进细胞外基质的合成，其糖胺多糖的含量至少是无压力培养组的两倍，并与液态压力的压缩模量有量效关系。1.5传代次数目前，国内外 有关传代对BMSCs向软骨细胞诱导分化影响的研究尚少。Banfi[19]等研究表明BMSCs在传至第4代时成软骨能力即开始降低，24次倍增后成软骨能力丧失。但胡静波等[20]表明将人BMSCs进行24次倍增后倍增能力丧失，但成软骨能力人保留。霍建忠等[21]将不同代BMSCs经成软骨诱导后，RT-PCR检测蛋白多糖mRNA表达及甲苯胺蓝染色，结果显示第6代后BMSCs成软骨能力减弱。建议BMSCs作为软骨组织工程种子细胞应选择第3、4、5代行成软骨诱导。1.6细胞接种密度胚胎发育过程中体内软骨形成的最早形态学变化是间充质细胞间距缩小，细胞与细胞之间形成紧密接触状[22]。细胞局部聚集是软骨形态发生前的重要步骤。这种细胞的局部聚集被认为是由细胞与细胞之间的粘附分子或细胞外基质成分如纤维粘连蛋白，层粘连蛋白所介导，并可以被细胞间粘附分子钙粘素所加强[23]。上文提到的能诱导分化为软骨细胞的细胞微球和离心沉淀形成的细胞团都是给BMSCs生长提供一个高密度三维生长环境，这种环境有利于细胞与细胞之间及细胞与细胞外基质之间的信号传递，类似于胚胎发育过程中软骨形态发生前间充质细胞聚集。研究表明，接种密度大于1×106／cm2能促进BMSCs分化为软骨细胞，而且能使细胞外基质在一定时间内迅速形成[24]。Ponticiello[25]等将人BMSCs以不同密度接种于明胶海绵，在含TGF-ß3的化学限定培养基中培养，结果表明细胞的接种密度影响细胞产生糖胺多糖和Ⅱ型胶原的能力，以12×106个／ml的密度最为有效。 2物理因素2.1低氧环境大量研究表明低氧环境有利于BMSCs向软骨细胞分化。MOUSSAVI-HARAMI等[26]通过观察体积分数0.21、0.05两种氧分压下的软骨细胞和间充质干细胞的培养发现，在体积分数0.21氧分压下的软骨细胞和间充质干细胞的增殖受到严重的削弱，并且氧化产物大量堆积。Ohnishi等[27]研究发现低氧促进了BMSCs增殖因子的基因表达，如结缔组织生长因子、成纤维细胞生长因子7、血小板源性生长因子A。而且发现在短时间内这些因子表达水平与低氧培养时间成正相关。Robins等[28]研究表明，低氧条件下培养BMSCs，软骨细胞标记物Sox-9基因表达明显增加，说明低氧促进BMSCs向软骨细胞分化。Martin-Rendon等[29]在低氧条件下培养BMSCs24小时后发现短时间的低氧环境有利于BMSCs的增殖和向软骨分化。Grayson等[30]将BMSCs在三维环境下进行长时间低氧培养，发现体积分数为2%的低氧刺激能增强BMSCs的增殖和向软骨细胞分化。关节腔内环境是一种低氧的环境，在体外低氧环境下诱导培养的BMSCs能向软骨细胞分化，可能正是因为这种低氧环境近似于关节腔环境。2.2力学刺激研究发现适当的力学刺激对BMSCs向软骨细胞分化有一定的积极作用。上文也提到生物反应器产生的微重力环境和流体灌注压能促进BMSCs分化为软骨细胞。刘天一等[31]将猪BMSCs 在离心机中培养，2次/天，每次30min，结果发现微重力能诱导BMSCs向软骨细胞分化，并形成软骨陷窝样结构。吕昌伟等[32]将BMSCs放置在12r／min的旋转培养箱中培养，结果发现微重力能够显著促进成软骨分化，同时也提高了II型胶原以及蛋白多糖等软骨特异性基质的沉积。Angele等[33]在循环流体静压力刺激条件下培养BMSCs，2w和4w后发现，蛋白多糖和II型胶原在基因水平和蛋白质水平上都显著提高，表明细胞向软骨细胞分化。并应用单纯的力学刺激诱导部分BMSCs分化为软骨细胞。证明了单一的力学因素可以促进BMSCs向软骨细胞分化。Mouw等[34]研究表明力学刺激可以促进TGF-ß1的信号传导，而TGF-ß1能提高BMSCs对力学刺激的敏感性，进而促进成软骨分化。虽然单一的力学刺激能诱导部分BMSCs成软骨分化，但力学刺激与转化生长因子等协同作用能更好地促进BMSCs分化为软骨细胞。3支架材料和细胞因子组织工程的三大要素即：种子细胞，支架材料和细胞因子。在以BMSCs为种子细胞的软骨组织工程中，选择对BMSCs生长增殖及向软骨细胞分化有积极作用的的支架材料和细胞因子非常重要。3.1细胞因子目前研究最多的促进BMSC成软骨分化的细胞因子主要有转化生长因子-ß（TGF-ß）、骨形态发生蛋白（BMP）、碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）和胰岛素样生长因子(IGF)等。TGF-ß是一族具有多种功能的多肽,可以调节多种细胞的增殖和分化。1998年 JOHNSTONE等[35]率先在体外诱导成年哺乳动物BMSCs分化生成软骨获得成功，证明了TGF-ß1具有促BMSCs成软骨能力。BARRY等[36]通过TGF-ß2和TGF-ß3也成功诱导BMSCs分化为软骨细胞。BMP属于TGF-ß超家族成员，至今已有40多种BMP被成功地分离。Sekiya等[37]研究发现BMP-2、BMP-4和BMP-6均可诱导人BMSCs向软骨细胞方向分化，其中BMP-2成软骨表达比效率更高。TGF超家族内不同因子间有协同作用，在诱导BMSCs成软骨分化时，单一因子不如多因子联合诱导。成纤维生长因子是关节软骨中一种重要的自分泌生长因子，在BMSCs表面表达有成纤维细胞生长因子受体。b-FGF是成纤维生长因子的一种，有促进BMSCs成软骨分化作用。TSUTSUMI等[38]在培养基中加入b-FGF对BMSCs进行扩增，随后行微球培养，4d后，微球表面出现球形软骨细胞，并被软骨特征性的蛋白多糖围绕，结果明显优于对照组。IGF包括IGF-1和IGF-2。IGF-1是最早确认的对关节软骨具有自分泌调节作用的生长因子。可促进BMSCs向软骨细胞分化，有利于软骨生长。不同物种的BMSCs向软骨分化需要不同的生长因子。不同的生长因子在诱导分化中有着协同作用。如何更好的让细胞因子在诱导BMSCs向软骨细胞分化中发挥积极作用还有待研究。3.2支架材料在以BMSCs为种子细胞的软骨组织工程中，良好的支架材料不仅要有良好的生物相容性；良好的空隙结构；良好的降解率；有利于细胞贴附生长； 无细胞毒性等特点外，还必需使细胞和材料复合后能成功地向软骨细胞诱导分化。目前软骨组织工程支架材料种类繁多，主要可分为三类:①天然高分子支架材料，如藻酸盐、壳聚糖、胶原等；②人工合成材料，如聚乙二醇(PEG)、多肽、聚乳酸(LA)、聚羟基乙酸(PGA)等；③复合材料，如胶原／壳聚糖、聚氧化乙烯／甲壳素／壳聚糖、壳聚糖／明胶等。多数支架材料都具有较好的三维结构，这种三维结构为BMSCs提供的三维生长环境有利于细胞成软骨分化。Diduch等[39]将MSCs与不同材料复合培养，发现在琼脂糖中培养的MSCs的II型胶原、蛋白多糖含量增长最快，藻酸盐次之；胶原凝胶随培养时间延长会发生体积回缩，而藻酸盐不仅能促进MSCs成软骨，而且长期培养中体积不会发生变化。王觅格等[40]将MSCs、TGF-ß1与多孔三维立体结构的PLLA/明胶复合,在动物体内成功构建组织工程软骨组织。大量研究表明，多种支架材料和BMSCs复合后都能成功诱导为软骨细胞。其原因除了与材料的三维结构有关外，还可能与材料成分等其他因素也有关系。4基因修饰多种细胞因子有促进BMSCs成软骨分化作用。但是外源性生长因子半衰期较短，需要较大剂量或连续给药才能对细胞产生持续性诱导刺激作用。基因组织工程技术将编码特定功能的基因转入种子细胞或生物活性基质材料，使转染细胞或基因活化基质表达目的基因，表达产物能在体内促进种子细胞的增殖分化及发挥正常生理功能，最终构建出具有特定修复功能的人工组织或器官[41]。研究表明BMSC能被IGF-1和TGF-ß家族基因通过载体介导转染 ，并向软骨细胞诱导分化。LuiKE[42]等将TGF-ß2基因通过脂质体转入人的BMSCs,行单层培养，结果发现TGF-ß2在整个细胞培养过程中都有表达，转染后48h能表达产生Ⅱ型胶原，持续4周后仍能表达和合成。郭晓东等[43]研究表明将适当剂量的TGF-ß1基因转人BMSCs，不仅可促进BMSCs增殖和调控其向成软骨方向定向分化，而且可抑制IL-1等多种炎性介质的生物学活性。杨自权等[44]通过脂质体介导Sox9基因成功地转染兔骨髓MSCs，高密度细胞培养2周后发现细胞表达软骨特异性Ⅱ型胶原和蛋白多糖。PalmerGD[45]等研究发现以腺病毒为载体转染TGF-ß1、BMP-2和IGF-1基因的BMSCs都能向软骨细胞分化，但当三种基因共同转染BMSCs时，即使少量的转染基因，其蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达也远高于单基因转染。多基因共同转染BMSCs，使得多种基因能联合发挥作用，进而获得更大的促增殖能力和成软骨效应。这也将是基因技术在软骨组织工程中的研究趋势。5其他因素地塞米松，维生素C对BMSCs成软骨分化也有促进作用[35]。还有诸如细胞来源、PH、胰酶浓度等都可能是影响BMSCs向软骨细胞分化的因素。综上所述，影响BMSCs向软骨细胞分化的因素很多，需将这些因素进行优化组合才能扩大BMSCs的成软骨效应。如通过贴壁筛选法分离细胞；应用DMEM-HG，10%胎牛血清在低氧环境下三维动态高密度培养BMSCs；给予适当的力学刺激；在培养基中加入适量的细胞因子、地塞米松和维生素C等；通过基因转染诱导BMSCs 成软骨分化。虽然研究表明：多种细胞因子联合诱导及多基因共同转染对BMSCs有着更大的成软骨效应。但联合细胞因子的种类、细胞因子的浓度、转染基因的种类、转染基因的量等都尚未明确，有待进一步探讨。